方阻仪原理

不溶性微粒分析仪阻法检测原理药典规定检测原理—光阻法满足《美国药典》、《中国药典》、《药包材标准》及输液器具 GB8368-2018 等要求。待测液体流过流通池，流通池两侧装有光学玻璃，激光器的光束通过透镜组准直 穿过流通池，照射在光陷阱上。若待测液体中没有微粒，则光电探测器接收不到光信号；若液体中有微粒，与液体流向垂直的入射光，由于被微粒阻挡而减弱，因此由传感器输出的信号降低，这种信号变化与微粒的截面积成正比。根据信号的幅度和个数可以对液体中的微小微粒进行计数检测。图.光阻法检测原理示意图PULUODY 的创新型双激光窄光微粒检测技术不仅对微粒的探测范围宽广更具有精度高、重复性好的特点，让任何微粒无处遁形。

前文回顾：发明人库尔特的传奇人生——颗粒表征电阻法（上）一、经典库尔特原理在经典电阻法测量中，壁上带有一个小孔的玻璃管被放置在含有低浓度颗粒的弱电解质悬浮液中，该小孔使得管内外的液体相通，并通过一个在孔内另一个在孔外的两个电极建立一个电场。通常是在一片红宝石圆片上打上直径精确控制的小孔，然后将此圆片通过粘结或烧结贴在小孔管壁上有孔的位置。由于悬浮液中的电解质，在两电极加了一定电压后（或通了一定电流后）， 小孔内会有一定的电流流过（或两端有一定的电压），并在那小孔附近产生一个所谓的“感应区”。含颗粒的液体从小孔管外被真空或其他方法抽取而穿过小孔进入小孔管。当颗粒通过感应区时，颗粒的浸入体积取代了等同体积的电解液从而使感应区的电阻发生短暂的变化。这种电阻变化导致产生相应的电流脉冲或电压脉冲。图1 颗粒通过小孔时由于电阻变化而产生脉冲在测量血球细胞等生物颗粒时所用的电解质为生理盐水（0.9%氯化钠溶液），这也是人体内液体的渗透压浓度，红细胞可以在这个渗透压浓度中正常生存，浓度过低会发生红细胞的破裂，浓度过高会发生细胞的皱缩改变。在测量工业颗粒时，通常也用同样的电解质溶液，对粒度在小孔管测量下限附近的颗粒，用 4%的氯化钠溶液以增加测量灵敏度。当颗粒必须悬浮在有机溶剂内时，也可以加入适用于该有机溶液的电解质后，再用此有机 溶液内进行测量。通过测量电脉冲的数量及其振幅，可以获取有关颗粒数量和每个颗粒体积的信息。测量过程中检测到的脉冲数是测量到的颗粒数，脉冲的振幅与颗粒的体积成正比，从而可以获得颗粒粒度及其分布。由于每秒钟可测量多达 1 万个颗粒，整个测量通常在数分钟内可以完成。在使用已知粒度的标准物质进行校准后，颗粒体积测量的准确度通常在 1-2%以内。通过小孔的液体体积可以通过精确的计量装置来测量，这样就能从测量体积内的颗粒计数得到很准确的颗粒数量浓度。 为了能单独测量每个颗粒，悬浮液浓度必须能保证当含颗粒液体通过小孔时，颗粒是一个一个通过小孔，否则就会将两个颗粒计为一个，体积测量也会发生错误。由于浓度太高出现的重合效应会带来两种后果：1）两个颗粒被计为一个大颗粒；2）两个本来处于单个颗粒探测阈值之下而测不到的颗粒被计为一个大颗粒。颗粒通过小孔时可有不同的途径，可以径直地通过小孔，但也可能通过非轴向的途径通过。非轴向通过时不但速度会较慢，所受的电流密度也较大，结果会产生表观较大体积的后果，也有可能将一个颗粒计成两个[1]。现代商业仪器通过脉冲图形分析可以矫正由于非轴向流动对颗粒粒度测量或计数的影响。图2 颗粒的轴向流动与非轴向流动以及产生的脉冲经典库尔特原理的粒度测量下限由区分通过小孔的颗粒产生的信号与各种背景噪声的能力所决定。测量上限由在样品烧杯中均匀悬浮颗粒的能力决定。每个小孔可用于测量直径等于 2%至 80%小孔直径范围内的颗粒，即 40:1 的动态范围。实用中的小孔直径通常为 15 µm 至 2000 µm，所测颗粒粒度的范围为 0.3 µm 至 1600 µm。如果要测量的样品粒度分布范围比任何单个小孔所能测量的范围更宽，则可以使用两个或两个以上不同小孔直径的小孔管，将样品根据小孔的直径用湿法筛分或其他分离方法分级，以免大颗粒堵住小孔，然后将用不同小孔管分别测试得到的分布重叠起来，以提供完整的颗粒分布。譬如一个粒径分布为从 0.6 µm 至 240 µm 的样品，便可以用 30 µm、140 µm、400 µm 三根小孔管来进行测量。 库尔特原理的优点在于颗粒的体积与计数是每个颗粒单独测量的，所以有极高的分辨率，可以测量极稀或极少个数颗粒的样品。由于体积是直接测量而不是如激光衍射等技术的结果是通过某个模型计算出来的，所以不受模型与实际颗粒差别的影响，结果一般也不会因颗粒形状而产生偏差。该方法的最大局限是只能测量能悬浮在水相或非水相电解质溶液中的颗粒。使用当代微电子技术，测量中的每个脉冲过程都可以打上时间标记后详细记录下来用于回放或进行详细的脉冲图形分析。如果在测量过程中，颗粒有变化（如凝聚或溶解过程，细胞的生长或死亡过程等），则可以根据不同时间的脉冲对颗粒粒度进行动态跟踪。 对于球状或长短比很接近的非球状颗粒，脉冲类似于正弦波，波峰的两侧是对称的。对很长的棒状颗粒，如果是径直地通过小孔，则有可能当大部分进入感应区后，此颗粒还有部分在感应区外，这样产生的脉冲就是平台型的，从平台的宽度可以估计出棒的长度。对所有颗粒的脉冲图形进行分析，可以分辨出样品中的不同形状的颗粒。 大部分生物与工业颗粒是非导电与非多孔性的。对于含贯通孔或盲孔的颗粒，由于孔隙中填满了电解质溶液，在颗粒通过小孔时，这些体积并没有被非导电的颗粒物质所替代而对电脉冲有所贡献，所以电感应区法测量这些颗粒时，所测到的是颗粒的固体体积，其等效球直径将小于颗粒的包络等效球直径。对于孔隙率极高的如海绵状颗粒，测出的等效球直径可以比如用激光粒度仪测出的包络等效球小好几倍。 只要所加电场的电压不是太高，通常为 10 V 至 15 V，导电颗粒譬如金属颗粒也可以用电阻法进行测量，还可以添加 0.5%的溴棕三甲铵溶液阻止表面层的形成。当在一定电流获得结果后，可以使用一半的电流和两倍的增益重复进行分析，应该得到同样的结果。否则应使用更小的电流重复该过程，直到进一步降低电流时结果不变。 在各种制造过程中，例如在制造和使用化学机械抛光浆料、食品乳液、药品、油漆和印刷碳粉时，往往在产品的大量小颗粒中混有少量的聚合物或杂质大颗粒，这些大颗粒会严重影响产品质量，需要进行对其进行粒度与数量的表征。使用库尔特原理时，如果选择检测阈值远超过小颗粒粒度的小孔管（小孔直径比小颗粒大 50 倍以上），则可以含大量小颗粒的悬浮液作为基础液体，选择适当的仪器设置与直径在大颗粒平均直径的 1.2 倍至 50 倍左右的小孔，来检测那些平均直径比小颗粒至少大 5 倍的大颗粒 [2]。 二、库尔特原理的新发展 可调电阻脉冲感应法可调电阻脉冲感应法（TRPS）是在 21 世纪初发明的，用库尔特原理测量纳米颗粒的粒度与计数。在这一方法中，一个封闭的容器中间有一片弹性热塑性聚氨酯膜，膜上面有个小孔，小孔的大小（从 300 nm 至 15 m）可根据撑着膜的装置的拉伸而变来达到测量不同粒度的样品。与经典的电阻法仪器一样，在小孔两边各有一个电极，测量由于颗粒通过小孔而产生的电流（电压） 变化。它的主要应用是测量生物纳米颗粒如病毒，这类仪器不用真空抽取液体，而是用压力将携带颗粒的液体压过小孔。压力与电压都可调节以适用于不同的样 品。由于弹性膜的特性，此小孔很难做到均匀的圆形，大小也很难控制，每次测得的在一定压力、一定小孔直径下电脉冲高度与粒度的关系，需要通过测量标准颗粒来进行标定而确定。图3 可调电阻脉冲感应法示意图当小孔上有足够的压力差时，对流是主要的液体传输机制。 由于流体流速与施加的压力下降成正比，颗粒浓度可以从脉冲频率与施加压力之间线性关系的斜率求出。但是需要用已知浓度的标准颗粒在不同压力下进行标定以得到比例系数[3]。 这个技术在给定小孔直径的检测范围下限为能导致相对电流变化 0.05%的颗粒直径。检测范围的上限为小孔孔径的一半，这样能保持较低程度的小孔阻塞。典型的圆锥形小孔的动态范围 为 5:1 至 15:1，可测量的粒径范围通常从 40 nm 至 10 µm。 此技术也可在测量颗粒度的同时测量颗粒的 zeta 电位，但是测量的准确度与精确度都还有待提高，如何排除布朗运动对电泳迁移率测量的影响也是一个难题[4]。微型化的库尔特计数仪随着库尔特原理在生物领域与纳米材料领域不断扩展的应用，出现了好几类小型化（手提式）、微型化的库尔特计数仪。这些装置主要用于生物颗粒的检测与计数，粒度不是这些应用主要关心的参数，小孔的直径都在数百微米以内。与上述使用宏观压力的方法不同的是很多这些设计使用的是微流控技术，整个装置的核心部分就是一个微芯片，携带颗粒的液体在微通道中流动，小孔是微通道中的关卡。除了需要考虑液体微流对测量带来的影响，以及可以小至 10 nm 的微纳米级电极的生产及埋入，其余的测量原理和计算与经典的库尔特计数器并无两致。这些微芯片可以使用平版印刷、玻璃蚀刻、 防蚀层清除、面板覆盖等步骤用玻璃片制作[5]， 也可以使用三维打印的方式制作[6]。一些这类微流控电阻法装置已商业化。图4 微流计数仪示意图利用库尔特原理高精度快速的进行 DNA 测序近年来库尔特原理还被用于进行高精度、快速、检测误差极小的 DNA 或肽链测序。这个技术利用不同类型的纳米孔，如石墨烯形成的纳米孔或生物蛋白质分子的纳米孔，例如耻垢分枝杆菌孔蛋白 A（MspA）。当线性化的 DNA-肽复合物缓慢通过纳米孔时，由于不同碱基对所加电场中电流电压的响应不同，通过精确地测量电流的变化就可对肽链测序。由于此过程不影响肽链的完整性，如果将实验设计成由于电极极性的变化而肽链可以来 回反复地通过同一小孔，就可以反复地读取肽链中的碱基，在单氨基酸变异鉴定中的检测误差率可小于 10-6[7,8]。图5 纳米孔 DNA 测序库尔特原理的标准化 早在 2000 年，国际标准化组织就已成文了电感应区法测量颗粒分布的国际标准（ISO 13319），并得到了广泛引用。在 2007 年与 2021 年国际标准化组织又前后两次对此标准进行了修订。中国国家标委会也在 2013 年对此标准进行了采标，成为中国国家标准（GB/T 29025-2012）。参考文献【1】Berge, L.I., Jossang, T., Feder, J., Off-axis Response for Particles Passing through Long Apertures in Coulter-type Counters, Meas Sci Technol, 1990, 1(6), 471-474. 【2】Xu, R., Yang, Y., Method of Characterizing Particles, US Patent 8,395,398, 2013. 【3】Pei, Y., Vogel, R., Minelli, C., Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS), In Characterization of Nanoparticles, Measurement Processes for Nanoparticles, Eds. Hodoroaba, V., Unger, W.E.S., Shard, A.G., Elsevier, Amsterdam, 2020, Chpt.3.1.4, pp117-136.【4】Blundell, E.L.C.J, Vogel, R., Platt, M., Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing, Langmuir, 2016, 32(4), 1082–1090. 【5】Zhang, W., Hu, Y., Choi, G., Liang, S., Liu, M., Guan, W., Microfluidic Multiple Cross-Correlated Coulter Counter for Improved Particle Size Analysis, Sensor Actuat B: Chem, 2019, 296, 126615. 【6】Pollard, M., Hunsicker, E., Platt, M., A Tunable Three-Dimensional Printed Microfluidic Resistive Pulse Sensor for the Characterization of Algae and Microplastics, ACS Sens, 2020, 5(8), 2578–2586. 【7】Derrington, I.M., Butler, T.Z., Collins, M.D., Manrao, E., Pavlenok, M., Niederweis, M., Gundlach, J.H., Nanopore DNA sequencing with MspA, P Natl Acad Sci, 107(37), 16060-16065, 2010. 【8】Brinkerhoff, H., Kang, A.S.W., Liu, J., Aksimentiev, A., Dekker, C., Multiple Rereads of Single Proteins at Single– Amino Acid Resolution Using Nanopores, Science, 374(6574), 1509-1513, 2021. 作者简介许人良，国际标委会颗粒表征专家。1980年代前往美国就学，受教于20世纪物理化学大师彼得德拜的关门弟子、光散射巨擘朱鹏年和国际荧光物理化学权威魏尼克的门下，获博士及MBA学位。曾在多家跨国企业内任研发与管理等职位，包括美国贝克曼库尔特仪器公司颗粒部全球技术总监，英国马尔文仪器公司亚太区技术总监，美国麦克仪器公司中国区总经理，资深首席科学家。也曾任中国数所大学的兼职教授。 国际标准化组织资深专家与召集人，执笔与主持过多个颗粒表征国际标准 美国标准测试材料学会与化学学会的获奖者 中国颗粒学会高级理事，颗粒测试专业委员会常务理事 中国3个全国专业标准化技术委员会的委员 与中国颗粒学会共同主持设立了《麦克仪器-中国颗粒学报最佳论文奖》浸淫颗粒表征近半个世纪，除去70多篇专业学术论文、SCI援引近5000、数个美国专利之外，著有400页业内经典英文专著《Particle Characterization： Light Scattering Methods》，以及即将由化学工业出版社出版的《颗粒表征的光学技术及其应用》。点击图片查看更多表征技术

目前市场上有大量的益生菌品牌和产品，但质量参差不齐，给消费者带来极大困扰，也阻碍了产业的健康发展。此问题的根源在于目前业界缺乏快速、准确、全面、低成本的益生菌产品质检手段。青岛能源所单细胞中心联合中国食品发酵工业研究院、青岛东海药业和青岛星赛生物科技有限公司等，开发了基于拉曼组原理的益生菌单细胞质检技术SCIVVS，为突破这一紧迫的技术瓶颈提供了全新的解决方案。该工作近日发表于iMeta杂志。 基于拉曼组原理发明益生菌单细胞质检技术SCIVVS 　　益生菌产品的市场规模已近千亿，但是存在大量的“鱼目混珠”现象。其重要原因是益生菌质检的方法学局限性。由于这些方法大多依赖于分离培养或元基因组测序，因此存在耗时长、成本高、难以快速测定细胞活性和代谢活力及其细胞间异质性、复合益生菌产品深度质检困难、流程繁琐、难以自动化等瓶颈性问题。这些局限性导致益生菌产品难以快速、低成本、全面、深度地进行质检，很大程度上阻碍了益生菌产业的健康发展。 　　针对这一产业瓶颈，青岛能源所单细胞中心张佳副研究员、任立辉高级工程师、张磊博士、公衍海助理研究员等带领的研究小组，联合中国食品发酵工业研究院、青岛东海药业和青岛星赛生物等团队，基于拉曼组原理，开发了一种名为SCIVVS(Single-Cell Identification, Viability and Vitality tests and Source-tracking)的单细胞精度益生菌质检技术体系。针对益生菌产品，SCIVVS首先不是提取总核酸或者进行平板培养，而是提取所有的细胞进行重水饲喂和单细胞拉曼光谱的高通量采集。在每一张拉曼光谱上，利用其指纹区，基于与益生菌单细胞拉曼光谱参照数据库的比对，快速完成每个细胞的种类鉴定环节。通过构建21种法定可食用益生菌的标准菌株拉曼光谱数据库，SCIVVS可实现平均高达93%的分辨准确度。同时，利用其重水利用峰(C-D峰)，则可针对每个物种，量化每个细胞的活性、代谢活力等。进而可通过拉曼激活单细胞分选技术，快速获得目标种类或目标代谢活力的单细胞，从而对接下游单细胞全基因组测序或培养。 　　为了支撑SCIVVS，在国家重大科学仪器研制、国家重点研发计划等项目的支持下，青岛能源所和青岛星赛生物合作研制成功了单细胞拉曼光镊分选仪(RACS-Seq)、高通量流式拉曼分选仪(FlowRACS)等原创仪器产品。运用RACS-Seq，研究人员直接从纯种或复合益生菌产品出发，在5个小时之内，完成了精确到每个物种的活细胞计数、活力定量和活力异质性测量。同时，针对乳酸杆菌、双歧杆菌或链球菌等各种益生菌，均能产出高质量的单细胞基因组(覆盖度可高达99.4%)，从而完成精准溯源。 　　对比目前的益生菌产品质检方法，SCIVVS具有快速、准确、全面、低成本、易于自动化等优势，较传统方法快20倍以上，而成本仅为传统方法的1/10，且能免培养、高精度、自动化、一站式地完成产品中每个物种的活细胞计数、活力定量、活力异质性测量和溯源，有望形成新的技术标准。在此基础上，该合作团队将基于“益生菌单细胞技术联盟(A-STEP)”，联合益生菌产业领军企业，建立一个“标准化”、“一站式”、“公益性”的技术服务体系，为实现从生产端到消费端的益生菌产品质量规范化，提供一个原创的、切实可行的解决方案。 　　该工作由单细胞中心徐健、中国食品发酵工业研究院姚粟、青岛东海药业崔云龙等主持完成，得到了国家自然科学基金、山东省自然科学基金和国家重点研发计划青年科学家项目等项目的支持。