基因测序仪工作原理

p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/e1b53786-6e16-4afb-80d3-15282f1c3af7.jpg" title=" 2.jpg" style=" width: 600px height: 446px " width=" 600" vspace=" 0" hspace=" 0" height=" 446" border=" 0" / /p p span style=" font-family: 微软雅黑, Microsoft YaHei " 　　在今年年初的J.P. 摩根大通医疗保健大会（J.P. Morgan Healthcare Conference）上，Illumina发表了堪称地表上最强的测序仪NovaSeq。全新的测序架构所带来的超高通量，让Illumina的总裁兼CEO Francis deSouza自信地宣示，百元基因组时代的来临已指日可待。从一月产品发布到Q3 财报公布时, Illumina已经出货近200台NovaSeq到客户手中。 br/ & nbsp br/ 　　无可匹敌的超高通量，是吸引许多客户眼球的第一元素。年初S2 流动槽最先上市，一个流动槽每次运行可达到28-33亿数量的reads / clusters。在双S2流动槽同时运行的情况下，使用2x150 bp读长，一次NovaSeq测序可以在一天半内解码16个人类基因体（平均30x覆盖深度）。10月中推出的S4流动槽，更将通量翻了三遍。一个S4流动槽每次运行可达到80-100亿数量的reads / clusters，所以双S4流动槽运行可以在不到两天内解码48个人类基因体（6万亿硷基通量）。S4的强大功能，将加速大规模基因组研究计画，对临床研究提供关键性的突破。如同哥伦比亚大学基因组医学研究所主任David B. Goldstein所言，NovaSeq系列所激发的研究规模和成本，都是一年前无法想像的。这全新系列的可扩展测序机不只帮助基因组医学走向更大规模的研究，也能推动实现如液态活检、肿瘤深度全基因组分析、和大数量单细胞测序等需要高覆盖深度或高强度的测序应用普及化。 br/ & nbsp br/ 　　NovaSeq高通量的可扩展性，满足不同产量的测序应用，也是其受到许多用户青睐的关键。除了可以选择S2 或S4流动槽，以及自由设定单槽或双槽同时运行之外，与S4同时推出的NovaSeq Xp工作流程让NovaSeq系统的灵活度更上一层楼。NovaSeq Xp工作流程的流动槽上样栈与试剂，让用户可以将文库直接上样到流动槽的单个通道中。由于每个通道的文库独立不混杂，用户可以根据通道来划分样本和项目。NovaSeq Xp工作流程带来更大的自由度，例如每个通道使用96个样本索引，每个流动槽一次可以测序384各样本。这样高度的多样本测序（multiplexing）也顺带减低了每个样本DNA所需的起始量。用户可以自由决定使用标准工作流程来混合各种文库类型在一个流动槽裡，或是利用NovaSeq Xp工作流程裡的上样栈实行新颖的样本索引方法，最佳化有效地利用地表上最高通量的测序仪。 br/ & nbsp br/ 　　NovaSeq 6000系统支援所有文库制备方法，例如全基因组测序（WGS）、靶向重测序（targeted resequencing）、RNA测序（RNA sequencing）、和甲基化测序（methylation sequencing）。用户可以在BaseSpace Sequencing Hub上找到NovaSeq产生的范例Illumina文库测序结果。 br/ br/ 　　更多关于NovaSeq系统规格和NovaSeqXp工作流程的细节，可以参考Illumina网站上的白皮书： br/ https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/datasheets/novaseq-6000-system-specification-sheet-770-2016-025.pdf br/ & nbsp br/ 　　除了NovaSeq S4流动槽和Xp工作流程，Illumina在10月推出的创新产品还包含了Nextera DNA Flex，一款全新的高性能全基因组测序（WGS）文库制备试剂盒。Illumina了解在NGS测序技术不断进步下，文库制备的技术也要跟上脚步，一起加速基因组医学爆发性地前进。目前许多实验室在NGS流程的文库制备阶段仍然遭遇瓶颈。多数文库制备流程以及前后的多个步骤，耗时又耗工。文库制备前需要DNA提取、定量和片段化，而文库制备后的步骤包括文库质量评估、文库浓度定量和归一化。这让许多实验室都要延误不少时间在文库制备流程，才能开始测序过程。 br/ & nbsp br/ 　　Nextera DNA Flex的核心技术为Bead-Linked Transposome （BLT），将Nextera的转座体（transposome）链接在磁珠上。BLT的On-Bead Tagmentation整合了DNA片段化（fragmentation）、片段接头化（adapter ligation）、和文库定量归一化（library normalization）的步骤，减少手动接触点并节省文库制备时间到2. 5小时。搭配Flex Lysis Reagent Kit的细胞裂解试剂，Nextera DNA Flex允许直接加入样本如血液、唾液、乾血纸片、和微生物菌株。直接加入样本进一步省去了样本制备的繁琐步骤，不需要辅助设备和试剂来提取DNA。从而将文库制备的整体周转时间，从样本到上测序机，缩短到三小时以内。Nextera DNA Flex的简约有助于自动化流程的使用。 br/ br/ 　　除了是Illumina产品线中最快且最简化的文库制备流程，Nextera DNA Flex的On-Bead Tagmentation提供了比in-solution tagmentation更均值的DNA片段化反应。当样本DNA起始量超过BLT的饱和点（大约是100ngDNA），过多的DNA便无法被片段化。不同于其他种文库制备方法，这样的化学特性使得Nextera DNA Flex片段化结果不会受到DNA定量的准确度影响。当DNA量介于100-500ng 之间，Nextera DNA Flex制备后的文库片段长度和上样量几乎是固定的。用户可以利用Nextera DNA Flex的广泛样本DNA起始量，灵活支持各种类型的基因组测序，简化日常操作。　 br/ & nbsp br/ 　　BLT与样本DNA饱和后带来的均匀文库片段长度和上样量，也提升了基因组测序覆盖度的均一性。不管是人类或非人类基因体，文库DNA片段均匀地覆盖在高与低的GC区域，没有偏好性。这样的通用特性让Nextera DNA Flex应用范围广泛，支持人类或其他大型/複杂基因组以及扩增子和微生物、寄生虫或真菌物种的测序，并且与Illumina各款测序仪完全兼容。用户可以在BaseSpace Sequencing Hub上找到Nextera DNA Flex应用在不同动植物和细菌基因体所产生的文库和在不同Illumina测序仪上的结果。 br/ br/ 　　更多关于Nextera DNA Flex的全新技术BLT原理、快速与整合的流程、以及全基因组测序表现和TruSeq Nano与Nextera XT的比较，请参考Illumina网站上的白皮书： br/ https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/datasheets/nextera-dna-flex-data-sheet-770-2017-011.pdf br/ br/ 　　另外两份白皮书详尽讨论Nextera DNA Flex的文库制备成果： /span /p p span style=" font-family: 微软雅黑, Microsoft YaHei " br/ /span /p p span style=" font-family: 微软雅黑, Microsoft YaHei " strong 人类基因体 /strong br/ https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/appnotes/nextera-dna-flex-human-genomes-application-note-770-2017-018.pdf br/ br/ strong 微生物基因体 /strong br/ https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/appnotes/nextera-dna-flex-small-genomes-application-note-770-2017-019.pdf br/ & nbsp br/ 　　今年十月份发布的这些新产品，NovaSeq S4流动槽、NovaSeq Xp工作流程（预计十二月份开始接受订购）、和Nextera DNA Flex文库制备试剂盒，再度展现Illumina的创新能力，并帮助加速基因组医学迈向大规模、高性能的全基因组研究之路。 br/ /span /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/8ccfe1a5-9088-43fc-b096-b005ae6f42b3.jpg" title=" 1.jpg" / /p p span style=" font-family: 微软雅黑, Microsoft YaHei " strong 作者简介 /strong br/ br/ 庄涵宇博士 br/ Illumina高级经理，生物信息和基因组应用合作 br/ Han-Yu Chuang br/ Senior Manager, Bioinformatics and Genomics Applications Partnerships, Illumina Inc. /span /p

p 　　“这一个项目我做了7年，这辈子能做几个这样的项目?它就像我的孩子一样，对于自己的孩子，哪怕再难、再苦我都要坚持。” /p p 　　“做科研就不能怕走弯路，我跌跌撞撞地走了这么多年，只是为了基因测序技术的国产化，哪怕没有资金和支持，我也要坚持做下去，因为这是我的‘孩子’。” /p p 　　说这话的人是中国科学院北京基因组研究所技术研发中心常务副主任、副研究员任鲁风。多年来，他不断地调整着研究方向，不断地学习不同学科的知识，为的就是研制出中国人自己的基因测序仪。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2015810545267550.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201508/insimg/14b6e2f4-ff1d-4525-b4b3-9fa5b7c70aab.jpg" / /p p style=" text-align: center " 任鲁风 /p p 　 strong 　初试牛刀 /strong /p p 　　22岁，毕业于南开大学生物系的任鲁风进入天津市某医院从事遗传性耳聋基因方面的基础研究，一个偶然的机会，他与基因结下了不解之缘。 /p p 　　在那里，他第一次接触到了“基因芯片”，这种在当时还很“时髦”的检测技术，就像给他“注射了一针兴奋剂”。当他得知北京一家公司正在建立基因芯片技术团队时，便毫不犹豫地放弃了在医院刚刚得到的晋升职位和稳定的工作，来到北京寻找他的梦想。 /p p 　　他的梦想与努力没有被辜负，经过多年心血与集体攻关，2003年由任鲁风主要完成的全球第一款SARS病毒全基因组芯片问世，并荣获了首都“抗击SARS集体一等功”。 /p p 　　“当时的基因芯片应用涉及了人类、动物、植物及病毒等方面，主要偏重于在基础研究中的应用，其中针对病毒进行鉴别检测的基因芯片是应用研究中主要的方向。”任鲁风向记者介绍说。 /p p 　　在他看来，在此之前，没有其他分子检测技术能够实现检测靶标的通量概念，基因芯片是第一种可以大规模并行化进行基因靶点检测的实用技术，“如果能够根据其特点应用于恰当的实践领域，将有其广阔的市场前景”。 /p p 　　可是好景不长，SARS过后，和国内众多新兴产业的轨迹一样，基因芯片产业进入了一个波谷期，公司内部业务调整，使得他不得不再次转行，寻找突破口。 /p p 　　2004年，他所在的部门裁撤，开始转岗从事基因治疗新药的研发和临床前实验研究工作。“不安分”的他总觉得还是没有找到自己的“归宿”，他始终坚信，没有应用前景的研究只能锁在象牙塔中，直到他进入中科院基因组所。 /p p 　　碰撞出的基因测序仪 /p p 　　2008年，中科院北京基因组所时任副所长于军研究员，也是任鲁风的博士生导师，针对生命科学仪器的发展提出了模块化DNA分析系统的概念，即对于DNA进行不同层次的分析时，可以是少数几种分子生物学核心技术的一种或多种的集成。此后，在与中科院半导体所的科研交流中，双方一拍即合，提出了研发当时技术复杂度最高，同时也是未来预期应用最广泛的第二代高通量基因测序仪的思路。 /p p 　　这个多学科碰撞出的火花，让当时刚刚进入测序技术研究领域的任鲁风激动不已。“进入研究组后，我才发现，原来我对基因组学、基因测序的了解是那么的浅显。”任鲁风说。 /p p 　　研究小组提出用不同学科领域的技术解决生命科学领域应用的问题。经过生物学和物理学两个看似完全不相干的团队历时半年的相互交流学习，任鲁风和同事们了解了半导体材料和相关的光电技术，也向他们普及了基因检测的相关知识。最终，联合研究组确定了研发基因测序仪所采取的技术路线。 /p p strong 　　再难也要做下去 /strong /p p 　　“2008年的时候，当时买一台类似的测序仪要花400万元，中科院给我们两年半时间，用406万元经费开发出一台测序仪，说实话当时我也觉得挺难的。”回忆起当年情景，任鲁风感慨万千。 /p p 　　“第一年走的弯路非常多，在摸索技术路线时，我们发现了很多问题。到2009年9月，项目要进行中期汇报时，我们才刚刚在仪器研发和技术开发方面入了门。当时非常焦虑，但是再难也要走下去。”任鲁风说。 /p p 　　从2009年9月到2011年4月验收结题，实际上他们只花了一年半时间便完成了这台基因测序仪原理样机的研发。个中曲折，已不能尽数。 /p p 　　功夫不负有心人。2011年3月，第一台基因测序仪原理样机搭建完成并功能实现，同年4月通过了中科院专家组的现场验收。 /p p 　　基因测序仪原理样机的研发成功不仅仅给了研究组信心，同样也为基因组所的学术方向结构完整性提供了有力的支持。在基因组所的“一三五”发展规划中，测序技术研发占据了非常重要的地位。任鲁风在当年博士毕业留所，自信满满地带领新成立的DNA测序技术研究开发中心团队进入下一个攻坚阶段——工程样机的开发工作，但却遇到了极大的困难，差点导致夭折。 /p p 　　工程样机的开发工作涉及到对仪器系统的全面重新设计，对各个部件都需要从工程化角度评估和测试，需要远远高于原理样机研发时所需要的经费。因为种种原因，这个项目虽然得到了研究所最大程度的支持，但一两百万元的经费对于这项工程来说实在是杯水车薪，争取国家项目资助又因为种种原因未获成功，开发工作一度陷入断粮状况。“最少的时候直接参与开发工作的只剩两三个人，我不得不争取一些小的项目咬牙支撑这个项目走下去。”任鲁风回忆起工程样机开发阶段的艰难也会有些唏嘘。 /p p 　　峰回路转，2013年10月，项目组与紫鑫药业达成协议，共建中科紫鑫公司实现基因测序仪项目产业化。科研项目的产业化转化所带来的资金和发展契机让任鲁风看到了希望。 /p p 　　“直到2015年1月，中科紫鑫已经完成了20多台机器，准备投放到遴选出的试用用户手里，让他们做免费的试用，我需要业内的评价。”任鲁风说。 /p p 　　国产自主知识产权的基因测序技术对国家的意义、国家在国际上的战略地位以及对精准医学的发展意义重大。任鲁风告诉记者，“我们的机器上市之后，国外的垄断企业一定会大幅度降价，对我国整体基因产业发展也会有更多的推进作用。” /p p 　　“这一个项目我做了7年，这辈子能做几个这样的项目?它就像我的孩子一样，对于自己的孩子，哪怕再难、再苦我都要坚持。”任鲁风说。 /p

编者按 NGS技术，到底是下一代测序，还是二代测序？NGS到底包含了哪些技术？关于NGS的定义，一直困扰着业内外人士。曾参与“国际人类基因组单体型图计划中国卷”项目 、“炎黄一号” 等多个重大科研项目的基因测序专家王威博士，近期发表了文章《浅议基因测序技术的代际》，文中清晰地解释了测序技术代际问题。小编特将该文转载，欢迎各位交流探讨。 正文： 相对于较早出现的Sanger双脱氧核苷酸测序技术（简称Sanger测序），2005年后出现的NGS测序技术，使得基因组研究进入高通量时代，促进了基因组学科学研究及技术转化应用。 在基因组学领域，NGS通常是next-generation sequencing的缩写，意为下一代或者新一代测序技术，亦有人称之高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS)、二代测序技术（second-generation sequencing）。至于到底哪些测序技术属于NGS，并无明确统一的界定，目前主要有两种观点，存在些许差别。 01 对NGS的最初种理解 自动化的Sanger测序技术，以Sanger技术为起点，新出现的技术被称为下一代测序技术（简称NGS）1。 这些新技术涉原理，依赖不同的模板制备方法(例如乳液PCR、DNA纳米球、桥式扩增 、单分子模板)、序列测定方法（焦磷酸测序、基于可逆终止化学测序、基于连接反应的测序、磷酸连接荧光核苷酸或实时测序）、基因组比对与组装方法等。 这种观点认为目前的大规模并行测序技术都属于NGS，包括Roche/454测序、Illumina/Solexa测序、Life的SOLiD与ION系列以及华大基因的BGISEQ/MGISEQ系列等；此外，持这种观点的学者还将Helicos BioScience、Pacific BioSciences以及Oxford Nanopore的单分子及纳米孔测序技术均纳入NGS技术，并未单独将其定义为第三代测序技术1～3。 02 对NGS第二种理解 另一种理解认为 NGS主要是指基于大规模并行测序（massively parallel sequencing，简写MPS）的测序技术4。 大规模并行测序的关键技术诞生于上世纪90年代，于2005年商业化进入市场。这一技术同时对成百上千万的待检测DNA模板分子进行测序，加大了测序反应的效率与通量，使得一次测序实验便能够完成一个或更多的人类基因组序列的测定。尽管不同的大规模并行测序技术原理各不相同，但有一些共同特点，杨焕明老师有非常简洁的总结5：（1）“裸”、“密”并行，每一个分子簇为一个裸露的测序反应，使得测序通量提高了几个数量级；（2）测序通量 的提高，损失了下机的读长（初期只有约20个碱基，现在已有显著提升）。 尽管MPS的标本制备和测序原理不同于Sanger测序，但它与Sanger 测序一样,仍需要对测序分子进行扩增，因而也不可避免的增加引入序列误差的概率和GC偏差，也不能直接分析不同修饰的核苷酸5。 按照这一观点，单分子测序不属于NGS，而是更加新的技术。 03 NGS：Next-generation 还是 Now-generation? 随着MPS成熟稳定，在2008～2010年左右，NGS有了一个新的含义，即Now-generation sequencing6、7，直译为“当代”或者“现代“测序技术。 也就是说，“下一代”测序技术变成了“现代”测序技术。不过，Now-generation sequencing这一说提法并未被广泛使用。因此在多数情况下，NGS主要是指Next-generation sequencing。 在高通量测序技术刚刚问世时，人们并没有预料到测序技术的后续发展如此迅猛。因此，无论是Next-generation 还是Now-generation，其实都是一个比较笼统的提法，本身也意味着变化和发展。这也就不难理解为什么目前对于哪些技术属于NGS会存在不同观点了。 04 关于测序技术的代际 上述话题牵涉出所谓的测序技术代际的问题。然而目前来看似乎并没有统一的认定。 如果按照上文对NGS的理解，目前的代际划分似乎更多的用来区分Sanger 测序与非Sanger 测序。这两类技术在原理和测序通量上都有存在较大差异，但也有相通之处。例如，无论是Sanger双脱氧核苷酸测序,还是高通量测序中的边合成边测序技术，或者是基于连接反应的测序，其原理都依赖核苷酸的聚合反应。 目前测序仪代际划分的分歧点主要围绕“二代测序”和“三代测序”技术。“三代测序”这种提法出现于2008～2009年，当时主要是指有别于NGS的新型测序技术。一些学者认为单分子测序、实时测序以及核心方法有别于已有技术的方法，应是三代测序技术的定义性特征。目前，三代测序通常是指无需DNA扩增的单分子测序技术4。这种技术从原理与特点来看，有其自身优势（比如测序能够获得较长的读长，有望解决单倍体基因组组装和结构变异识别），是测序技术发展的重要思路。 有学者指出，目前测序技术代际划分，也许更多的是出于商业上的考虑，因为人们通常习惯性的认为技术代际升级代表了技术的演化。例如，Pacific BioSciences 公司在其发表的论文中，将单分子实时测序技术与NGS进行了区分，被归入三代测序技术8，其用意是不言而喻的。 单分子测序技术早在2003年就有概念性的论文发表9。2008年，Helicos BioSciences推出了单分子测序仪，随后Pacific BioSciences与Oxford Nanopore也推出了各自商业化的测序仪。不过，也许是由于单分子测序对技术体系要求更高，这项技术的发展远不如当初人们预想得那般迅猛，直至今日尚未达到NGS这样的市场规模。这期间，Helicos BioScience已于2012年破产，尽管其技术符合目前对三代测序技术的界定。 随着更多的应用，单分子技术也陆续暴露出一些技术问题。例如，在近期的一篇论文中，研究人员对利用长读长测序技术组装的人类基因组进行分析，发现与短读长组装相比，长读长组装的蛋白编码区域含有更多的错误10。尽管有学者指出，新的生物信息学工具已经能够改善纳米孔测序的组装结果，有望从Oxford Nanopore和PacBio的测序数据中获得高质量的序列11。但是，真正的长读长技术，只有达到或超越现有技术的性能和准确度时，才有实用意义。 从测序技术应用角度来看，某些应用也许并不需要长读长的单分子测序技术。例如，基于外周血游离DNA测序的无创产前检测，因目标DNA本身就是一百多个碱基的短片段，采用NGS就能够比较好的进行检测与分析，且成本也在逐渐下降。此外，通过一些间接技术手段，比如华大智造近期推出的stLFR测序12，也能够在全基因组范围内提供基因组长片段信息，包括分型、突变及基因组结构变异。 单分子测序技术从原理上具备潜力与优势，值得进一步研发完善。但是未来能否达到预期的市场规模，甚至成为主流测序技术，还需要经过实践检验。技术发展代际内的升级相对比较频繁，而代际间的升级则相对缓慢，只有核心原理有创新并且跨越式超越前一代的技术，也许才更适合被定义为新一代技术。 总之，目前测序技术代际划分较为模糊，且测序技术目前仍处于快速发展中。其中，SANGER与 NGS均引领了基因组技术，推动了基因组学科技进步。前者为人类基因计划（HGP）做出了主要贡献，目前仍在是很多生物学与医学实验室的常规技术；后者则是当前基因组研究与应用的主流技术，直接为基因组测序的广泛应用扫清了经济上的障碍，使其不仅能更好的服务于科研，也正在成为医学界以及其他应用领域的重要工具。单分子技术则是测序技术发展的重要方向，开始崭露头角，但成熟与完善尚需时日。以上这些测序技术，均有各自的特点，也有其适合的应用范围与应用场景。 附笔： 写这篇小文的初衷，是近期因为有朋友提出过此类问题，也有人常将测序技术类比IT技术的发展。因此在这里分享自己的观点，也期望与持不同意见的朋友交流探讨。 特别感谢两位曾经参与过水稻基因组计划等早期基因组大项目的同事张建国博士与李胜霆博士，在春节假期期间分享了各自的观点，并协助完善本文。 目前测序技术的代际划分并没有统一的认定。即使一个人，其观点也会随时间与认知的改变而发生某些变化。在2008年前后，我们单位的NGS平台刚刚进入规模化稳定运行阶段。也正是那个时候，出现了“三代技术”。业内不少人都认为这类单分子技术很快将取代NGS。但事实并非如此。我曾经的观点认为单分子测序技术属于三代技术，而目前则倾向于将其归入NGS。 关于测序技术的代际，可以看看IT的代际。百度上是这样划分的：初代计算机被称为电子管计算机，第二代计算机被称为晶体管计算机，第三代计算机成为中小规模集成电路计算机，第四代计算机成为大规模和超大规模集成电路计算机，第五代计算机，指具有人工智能的新一代计算机。IT的代际划分主要源自技术原理的革新（第五代感觉主要是软件上的革新），是认识计算机发展史和技术原理的需要，具有客观存在的价值。新一代在性能上全面超越前一代。 从认识论的角度来讲，大家习惯于根据技术划分代际，代际升级代表了技术的演化。只有核心原理新并且跨越式超越前一代的技术才能被称为新一代。新一代的出现首先是从技术原理上提出，有希望和潜力超越现有技术，然后从商业角度宣传，有一些最终行不通的被淘汰，能发展成熟超越前一代的才会真正成为新一代。也有可能方向是对的，但是技术暂时跟不上，会经历曲折的发展。这种代际认识在回顾历史的时候最清楚。 王威 博士 华大智造副总裁，医学遗传学研究员，科学技术委员会成员。 先后参与、负责完成“国际人类基因组单体型图计划中国卷”项目 (简称 HapMap 计划) 北京区域的基因分型任务、初个中国人基因组图谱的绘制工作 (简称“炎黄一号”) 等多个重大科研项目。主要从事基因组医学新技术开发、推广与应用。