自动测序分析仪

p 　　对很多人来说，基因测序仪都是一个很陌生的名词。然而，如果你感受过独步世界的中国高铁技术，见证过中国发射的量子卫星，还听说过独占世界超算排行榜长达五年的中国超级计算机，那么处于全球领先地位的中国基因测序仪也绝对值得一探究竟。 /p p 　　人们常说，19世纪是蒸汽机的世纪，20世纪是汽车和计算机的世纪，而21世纪则是生命科学的世纪。生命科学研究将在医疗健康、体育运动、农业养殖、司法刑侦、太空探索等众多方面广泛而深远地改造人类生活。作为生命科学研究最核心的基础性工具，基因测序仪已经成为当前中美全面科技竞争的重要领域。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 什么是基因测序 /span /strong /p p 　　基因测序技术是基因组学研究的核心技术，是现代生命科学研究中最广泛应用的重要技术。你可能还不知道，地球上几乎所有你能看见和看不见的生命形式都是由基因编码而成的。塞满商场的人类、卖萌为生的熊猫，爬过阳台的甲虫、各类叫不上名字的树木花草以及数万亿和我们亲密接触的细菌、微生物，都是由DNA编码的生命体。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/a458d63e-538a-4d26-b3cd-50c2933870ba.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" / /p p 　　每一个生命都像是执行一段代码的程序，而DNA正是生命的源代码。相应地，破解生命源代码的技术，就是DNA测序。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 发现双螺旋——让测序成为可能 /span /strong /p p 　　如果说测序技术的进步是发掘矿藏的过程，那么还需要先行者告诉我们矿藏的方向和位置。完成这项任务的，正是科学界的两位顶尖人物——沃森和克里克。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/d812d00c-25b0-471a-91bf-31490093244a.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 双螺旋结构的发现者James Watson和Francis Crick /span /p p 　　1953年，沃森和克里克发现了DNA双分子螺旋结构，人类对生命的认识有了重大的突破，即：“生命是序列的，生命是数据的。”生命体的全基因组包含了其全部遗传信息，这些信息是A-T、C-G四种碱基两两配对后排列成的长链。这些碱基的排列信息可以被读取出来，以1010001的二进制形式存储在计算机中 可见，生命的密码是一组可以被数据化的碱基排布序列。因此，测定DNA序列就成为解读遗传信息的先决条件和整个生命科学研究的重要基础。 /p p 　　可以说，正是DNA双螺旋结构的发现，带动了DNA测序技术的大发展，开启了人类历史上方向明确而历时长久、道路曲折、投入巨大、进展惊人的探索。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 测序技术发展的四个阶段 /span /strong /p p 　　DNA双螺旋的发现，让破解生命源代码的DNA测序在原理上成为可能，现在我们就来回顾测序技术的具体发展，其主要经历了四个阶段。因篇幅所限，这篇文章将为你展示前两个阶段。 /p p 　　 strong 阶段1：从“前直读”到“直读” /strong /p p 　　1964年，即DNA螺旋被发现11年后，康奈尔大学的研究者第一次分析了酵母的核苷酸序列。这次研究标志着一个新时代的开始。不过，正如承载生命信息的大分子经历了从RNA到DNA的历程，最开始的测序方法是用来测定RNA序列的，实验用不同的RNA酶对RNA模板进行“消化”(digestion)，并根据反应后产物中可能重叠的序列间接推导可能的完整序列。这种测序技术流程繁琐，推导复杂，很难重复，验证还更为困难。不仅如此，在试图测定双链且更加稳定的DNA时，这种方法没能获得成功。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 305px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/f6459ef0-726f-4dab-805d-2c1b3ea314e1.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" width=" 600" height=" 305" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 直读法示例 /span /p p 　　在技术的发展史上，新技术的出现就像制作一个木桶，每一块木板都代表一种必须具备的基础条件，任意一块板的缺失都不构成一个木桶，同时，木板之间还需要彼此适应和融合。直接读取DNA序列的测序技术(即“直读法”)，正是这样一个木桶。它是在分子克隆技术、凝胶电泳技术、放射自显影三种技术全部成熟之后才出现的。在这三种技术的基础之上，直接读取DNA序列的SBC和SBS测序法问世。“直读法”的最大突破在于不再需要间接推导，而是可以直接在凝胶上按顺序直观读出测序模板，判断DNA分子每个碱基位置上为T-C还是A-G。 /p p 　　SBC与SBS这两种方法在原理上相似，但具体操作有诸多不同。SBC法使用化学试剂，有较强的毒性，且技术复杂较难掌握，成功率不高。相比之下，SBS法使用酶试剂，具有操作简便、结果稳定、准确性高且重复性好等特点。更有意思的是，运用SBS法的设备相对简单，可以实验室自制或采用通用设备，还有使用方便的标准化试剂盒，因此很快风靡全球相关实验室。SBS法由英国科学家桑格(Frederick Sanger)于1975年率先发明，因此也被称为Sanger法。这种直读法的发明也为DNA测序的数字化和自动化奠定了基础 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/dc28748a-368f-4144-8805-8b14db973ec8.jpg" title=" 4.jpg" alt=" 4.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " Sanger电泳法跑胶结果示例图 /span br/ /p p 　　 strong 阶段2：从手工到自动化 /strong /p p 　　上世纪80年代以前，分子生物学这门学科一直都被戏称为“现代技术、手工操作”，直到DNA测序技术出现，分子生物学才有了第一种实现自动化和信息化的技术。此后测序技术在几十年发展历程中不断吸收其他领域新技术(如物理领域的纳米技术及激光技术、化学领域的荧光标记核苷酸技术、生化领域的毛细管电泳分析、信息领域高密度芯片等技术)并将它们融为一体的成果，形成了现代科学研究技术中的强力工具。 /p p 　　1986年，加州理工学院的胡德(Leroy Hood)发明了以四种荧光物质标记测序反应产物的“四色荧光法”，这些荧光物质在不同波长的激光下呈现不同颜色。这项技术成为广受欢迎的SBS测序法(Sanger测序法)走向自动化的关键突破。　　 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/c56d19b1-381e-4039-89b4-c54f701e45ec.jpg" title=" 5.jpg" alt=" 5.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 四色荧光法原理示意图和自动测序仪的四色荧光“峰图” /span br/ /p p 　　这种方法将测序效率提高了数倍，读长达到500nt(nt：nucleotide 核苷酸，是衡量单链核酸的长度单位)，分辨率大为提高 而且，这是测序技术发展史上首次真正彻底抛弃了放射性物质的使用。测序效率也称为“通量“，是指单台设备一次反应所获取的序列数据量。 /p p 　　另外，还有一个与通量同样重要的概念——“读长”：测序仪的测序原理是将目标DNA大量复制，然后用酶将这些DNA长链切断，并分别对每一小段测序，最后将这些片段拼接还原成完整的长链。读长就是指测序仪能读出的每一个DNA片段的长度。这两个概念很重要，后面还会经常提到。 /p p 　　据此，美国ABI公司在1986年推出了第一台商品化的平板电泳全自动测序仪——ABI 370A。此后，该公司又推出了多种改进型，在读长、通量、准确性方面都有很大提高，这种自动化测序仪成为划时代的国际“人类基因组计划(HGP)”得以启动的重要技术依据。 /p p 　　尽管这一代测序仪为“人类基因组计划”做出了突出贡献，但只实现了测序过程的自动化，在自动测序之前的细菌克隆、手工制胶、手工加样等操作都需要消耗大量的人力。一组数据可以说明问题：在“人类基因组计划”冲刺阶段，华大在6个月的时间里完成了50万次成功的测序反应，共消耗了1500万个形状大小与医用“针头”类似的移液器吸头。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 0, 0) " 未完待续，详见下期： /span strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 爆发式的进步 /span /strong /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 小贴士 /strong /span /p p 　　 strong 1.人类基因组计划(Human Genome Project, HGP) /strong /p p 　　人类基因组计划是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。其宗旨在于测定组成人类染色体(指单倍体)中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。基因组计划是人类为了探索自身的奥秘所迈出的重要一步，是继曼哈顿计划和阿波罗登月计划之后，人类科学史上的又一个伟大工程。 /p p 　　这一计划于1990年正式启动。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。2001年，人类基因组工作草图发表。2003年4月14日，六国首脑共同宣布人类基因组测序胜利完成。 /p p 　　 strong 2.测序效率与读长 /strong /p p 　　测序效率也称为“通量”，是指单台设备一次反应所获取的序列数据量。测序仪的测序原理是将目标DNA大量复制，然后用酶将这些DNA长链切断，分别对每一小段测序，最后根据片段首尾重合的部分，拼接还原成完整的长链。读长就是指测序仪能读出的每一个DNA片段的长度。 /p p 　　 strong 3.SBC与SBS /strong /p p 　　这两种方法的原理相似，但具体操作有诸多不同。SBC法使用化学试剂，有较强的毒性，且技术复杂较难掌握，成功率不高。相比之下，SBS法使用酶试剂，具有操作简便、结果稳定、准确性高且重复性好等特点。且运用SBS法的设备相对简单，可以实验室自制或采用通用设备，还有使用方便的标准化试剂盒，因此很快风靡全球相关实验室。 /p

从安吉丽娜&bull 朱莉进行乳腺癌基因检测、个性化DNA检测被美国《时代》杂志评为年度最佳发明，到转基因食品大讨论，再到复旦大学日前关于曹操家族DNA的研究成果&hellip &hellip 今天，&ldquo 基因&rdquo 已当之无愧地成为一个全民话题。 　　2003年，人类绘制成功第一幅基因组工程(HGP)草图。10年来，由中国完成的基因测序物种目前已占全球一半以上，然而，专家表示，增强创新能力依然是我国基因组学发展的当务之急。 　　&ldquo 买枪打鸟&rdquo 亟待转型 　　作为全球最大的基因测序与分析研究中心，华大基因已完成近600个物种基因组测序和28200多个变异基因组研究。 　　&ldquo 测绘基因序列就像绘制元素周期表，是一切生命科学研究的必备工具和新科学发现的创新源头。&rdquo 在接受《中国科学报》采访时，华大基因杨碧澄博士说。 　　而测序技术的升级换代无疑为基因组学发展提供了强大的驱动力。从最初的手动测序仪到第一代ABI自动测序仪、第二代数百万个碱基大通量平行测序，再到第三代单分子实时DNA测序，绘制各种生物基因蓝图的成本和时间不断缩减。在此过程中，我国DNA测序应用能力也随之大幅提升。 　　然而专家指出，目前国内测序仪器基本仍依赖进口。&ldquo 如果我国基因组学研究总停留在用别国进口的&lsquo 枪&rsquo 来&lsquo 打鸟&rsquo 的阶段，怎么能够指望超越别人?&rdquo 中科院北京基因组所副所长于军质疑说。 　　在中科院院士赵国屏看来，我国测序仪原创能力不强与几千年来看不起雕虫小技的观念不无关系，这导致国家对技术创新的重视程度不如知识创新。 　　综合创新 沃土待培 　　&ldquo DNA测序是一门非常有用的技术，它对科学发展的意义超过航空母舰对现代战争的意义。&rdquo 于军说。 　　相关技术已经给美国带来科学史上空前的经济价值。24年来，HGP及其相关研究已给美国带来9650亿美元的经济效益和50多万个就业机会。 　　而巨大的经济收益正是以应用为基础。DNA测序已在临床上大放异彩，同时，测序技术也在农业、工业、养殖业等领域大显身手。&ldquo 以基因测序为基础的选择性育种可以加速新品种的培育周期、提高品种质量与多样性。&rdquo 杨碧澄说。 　　而动物基因结构研究不仅有助于了解决定动物各性状的控制基因以培育新品系，还可以辅助人类疾病机理研究、开发新药。微生物基因组研究则可以用于循环经济、环境生态等多个方面。 　　可以说，基因测序创新能力体现着一个国家的综合创新能力。对此，赵国屏表示，我国基因测序在一些技术和方法上虽然也有突破，但创新&ldquo 短板&rdquo 依然存在。 　　&ldquo 基因测序方面的综合创新不仅需要科学研究之间的交叉，还需要科学、技术、工程之间的互动，中国在这方面的土壤还很差。&rdquo 赵国屏感慨说。 　　在他看来，国内过分强调SCI文章和第一作者单位，不利于展开学科交叉和跨领域合作。同时，基因组学从研发到产业的上中下游转化链之间的角色定位、评价方式以及支持方式等都有待进一步厘清。 　　未来之路 创新为先 　　&ldquo 知道DNA组序列仅是知道遗传本质的第一步，未来新物种基因测序仍会继续增多，测序质量仍有待在现有草图基础上继续提高，研究层次上进一步向系统生物学与合成生物学方向发展。&rdquo 赵国屏说。 　　赵国屏认为，生命科学从技术突破到应用要经过两个产业化过程：一是为技术创新提供相应的综合配套手段，其目的是为科研服务 二是为民用服务。当前，基因测序两个产业化过程已并驾齐驱。 　　&ldquo 在这个过程中，要让基因组学研究与医、农、工相互结合，用于指导实践和进一步发展。&rdquo 赵国屏说。 　　从十几年前&ldquo 搭别人的车&rdquo ，完成1%的人类基因组计划，到&ldquo 十二五&rdquo 期间的&ldquo 万种微生物计划&rdquo 、&ldquo 千种动植物基因计划&rdquo 等生物工程，近20年来，随着国家科研投入增多，我国从事基因组学研究的人才创新队伍日益扩大，这些无疑都是未来中国基因测序创新的底蕴。

当前，基因测序仪的主要生产企业有Illumina、Life technologies、Pacific Biosciences等。近日，仪器信息网编辑随机采访了基因测序仪用户，所采访用户涉及高校、科研院所、测序公司的实验室等，共计3名用户，其中A用户使用Life technologies 公司产品ABI 3730XL，主要应用于PCR产物测序，质粒和细菌人工染色体的末端测序 B用户使用Illumina公司推出的 hiseq-2000，主要应用基因组组装、重测序、外显子测序、转录组测序以及小RNA测序的研究 C用户使用Pacific Biosciences公司研发生产的PacBio RSI，主要应用于基因组从头测序，检测DNA修饰。仪器信息网所采访的产品涵盖了第一、第二和第三代基因测序仪。 ABI 3730XL测序仪 Illumina hiseq-2000测序仪 PacBio RSI 测序仪 　　仪器价格：一代更比一代高 　　在采访中了解到，用户A所使用的ABI 3730XL测序仪购于2010年，当时购买的价格是100万元人民币左右，这是一款第一代测序仪，其基于毛细管电泳和荧光标记技术进行测序。 　　用户B使用的第二代测序仪Illumina hiseq-2000于2011年购买，价格约为75万美元，其采用可逆终止法的边合成边测序技术。 　　用户C使用的PacBio RS I测序仪是一款第三代测序仪，其利用DNA单分子的直接测序的原理进行测序。该仪器于2012年购进，当时购买价格约为100万美元。 　　用户开机率：普遍较高 　　A用户来自测序公司，每天都收到来自其他单位的测序样本，因此使用频率非常高，几乎每天都开机， 　　B用户来自科研机构，该仪器作为平台仪器，为单位所在的整个科研系统服务，两年中都是满负荷使用。 　　C用户来自高校，仪器主要为高校内部系统提供服务，1年中使用频率较高。 　　测序速率，读长，通量都可以满足需求 　　相比之下，ABI 3730XL测序仪的测序速度在第一代基因测序仪中是最高的。但是，由于其依赖于电泳分离技术，所以速率方面难以进一步升级，96样本的测序运行时间约为1小时40分钟。每天的数据通量可以达到600000bp，主要适合于基因测序和基因分型研究。 　　Illumina hiseq-2000测序仪作为第二代测序仪，测序速率大大提升，每天最高可以产生75Gb的数据。可以实现De Novo从头测序，DNA重测序等各种测序目标。 　　PacBio RSI的测序速度可以达到每分钟60个碱基，从样品制备到获得碱基序列的全部流程可在1天内完成。每天可获得的数据是200Mb mappable data。能够完成各种测序目标。 　　读长方面，ABI 3730XL的准确读长可以达到800bp。Illumina hiseq-2000测序仪读长可以达到2× 100bp。PacBio RSI目前可以获得1300bp的平均读长。 　　前处理环节：第三代测序仪优势明显 　　用户表示，ABI 3730XL和Illumina hiseq-2000虽然与同类仪器相比建库准备实验相对方便，但仍需花费较长时间和大量人力。但作为第三代测序平台的PacBio RSI测序仪，利用DNA单分子的直接测序的原理，无需进行文库制备，可直接从DNA片段获得测序数据，从样本制备到获得测序结果，所需的时间还不到一天。并且与传统标准方法相比，所需的DNA量也相当少，用量可低至不到500ng。 　　收费售后服务：用户满意度高 　　Illumina、Life technologies的售后服务获得了用户的一致认可，用户认为，其服务&ldquo 响应速度快，专业性高，解决问题十分彻底&rdquo 。 　　基因测序仪的产品生产商相对较少，过了免费的质保服务期之后，用户需要承担高额的售后服务费用，但几名用户对此并未产生不满，ABI 3730XL的用户表示，&ldquo 我们认为一年10万元的售后费用物有所值。&rdquo 　　改进意见：配套试剂耗材应降价 　　尽管ABI 3730XL在速度和成本方面都已达到了极限，但与二三代测序仪相比，其通量较低，成本较高，并且由于其对电泳分离技术的依赖，速度成本难以进一步提升。尽管如此，ABI 3730XL用户认为，ABI 3730XL方法可靠，并且已形成规模化，将继续发挥重要作用。 　　使用Illumina hiseq-2000的用户认为，该仪器的配套试剂价格过高，另外读长还有待增加，并且希望建库准备实验可以实现自动化。 　　PacBio，RSI的用户表示，这台仪器的不足之处主要在于试剂耗材价格过高，通量还有待提高。另外，PacBio RSI系统可购买升级包，将原有系统转化成最新的PacBio RSII，但是，升级耗资巨大也是令用户头痛的问题。 　　附：基因测序仪简介 　　DNA测序技术是现代生物学研究中重要的研究手段之一。成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。1977年，Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。同一时期，Sanger发明了双脱氧链终止法。20世纪90年代，荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序时代。目前，基因测序仪已发展到第三代，Illumina、Life technologies(ABI)等公司共同占据着全球基因测序仪市场。 撰稿编辑：乔峰