质谱微生物检测

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种软电离生物质谱，具有操作简便、结果高准确性、检测速度快和低成本等优点，目前已成为可靠的微生物快速鉴定技术，在微生物领域有着十分广泛的应用。 东西分析作为国产商品化质谱仪开拓者之一，对质谱仪技术及应用的开拓从未停止脚步。并在质谱仪器研发、生产与应用方面拥有丰富的经验和技术沉淀，2017年，东西分析推出MALDI-TOF 质谱-Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统。Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统是东西分析仪器有限公司开发的一款以MALDI-TOF为平台的多功能生物信息阅仪。它是一款多用途多功能的生物检测平台，既可以用于临床医学检测，也可以用于非临床领域诸如食品安全，非法添加，疾控，工业微生物等检测。 原 理 每种微生物都有独特的蛋白质组成。MALDI-TOF MS正是这样一种基于蛋白质检测的微生物快速鉴定技术。其原理是利用质谱技术将蛋白质按分子量大小排列形成独特的指纹图谱，通过测定某一细菌的蛋白质组成，并将特征峰与数据库中的参考谱图对比，即可对细菌进行准确的鉴定。 由此可见，数据库的种类谱图等成为制约MALDI-TOF MS的重要因素。Ebio ReaderTM 3700M拥有强大数据库,包含有4000余种微生物, 包括多种临床致病菌，能够实现菌种的实时鉴定，无需上网检索鉴定；其搭载的神经网络人工智能算法，可对基因型相近的难辨菌（大肠杆菌和志贺氏菌）进行准确区分。同时具有自建库功能，可根据用户的实际情况建立自己的特有菌种库。 应 用 （一）大肠埃希菌和志贺菌的鉴别大肠埃希菌和志贺菌是具有高度传染性、危害严重的革兰阴性肠道致病菌。这两种菌在菌落形态及生物学特性方面非常相似，常规的临床鉴定方法很容易混淆，即使通过16SrRNA测序也无法准确区分。Ebio ReaderTM 3700M利用具有深度学习分析功能的神经网络人工智能软件，可以实现对大肠埃希氏菌和志贺菌的准确区分鉴定。大肠埃希菌，福氏志贺菌和两种混合菌的指纹图谱人工智能算法准确鉴定难辨菌种（二）菌种鉴定MALDI-TOF MS不仅可以鉴定细菌，还可以用于细菌分型，亚种识别等。样品处理在Eppendorf 管中加入300µl 纯净水，挑取适量(5～10mg)菌体，混匀，再加入900 µl 无水乙醇，混匀后以12000r/min 离心2min，弃去上清液，待管中残留液体彻底干燥后，加入50µl 70% 甲酸，混匀，再加入50µl 乙腈，混匀，同样以12000r/min 离心2min，吸取上清液，与等体积的基质溶液（CHCA）混合，然后涂布于96 孔样品板上，自然晾干后进样。用校准品对仪器进行质量轴校正，随后利用Ebio ReaderTM 3700M质谱仪进行样品检测。仪器条件实验结果Ebio ReaderTM 3700M分析样品的质谱图根据所得图谱与数据库参考谱图匹配程度，软件可以计算得到分值。根据质谱仪鉴定分值，1.7时，结果高度可信。本实验中检测的样品质谱结果得分2.3，表示高属水平鉴定，可能的种水平鉴定。（三）地氯雷他定口服溶液药品中洋葱伯克霍尔德氏菌洋葱伯克霍尔德菌是一种无条件致病菌，可引发包括肺炎、败血症、心内膜炎、伤口感染、脓肿在内的多种感染，死亡率95%，被越来越多的制药企业和药监管理系统所重视。《中国药典》2020版也新增洋葱伯克霍尔德菌检查指标。菌种培养菌悬液制备：在生物安全柜内，将洋葱伯克霍尔德氏菌冻干粉溶于胰酪大豆胨液体培养基中，在32℃的电热恒温培养箱中培养，备用。样品制备1. 菌种阳性对照：在生物安全柜内，将洋葱伯克霍尔德氏菌冻干粉溶于胰酪大豆胨液体培养基中，在32℃的电热恒温培养箱中培养，备用。2. 地氯雷他定口服溶液：取三个批次地氯雷他定口服溶液溶于胰酪大豆胨液体培养基中，置32℃电热恒温培养箱中培养；3. 地氯雷他定口服溶液+菌种培养：取三个批次地氯雷他定口服溶液和已制备的菌悬液溶于胰酪大豆胨液体培养基中，置32℃电热恒温培养箱中培养；蛋白提取量取适量的待测样品，以5000r/min 离心5 min收集沉淀物，加入300µl 纯净水，混匀，再加入900 µl 无水乙醇，混匀后以12000r/min 离心2min，弃去上清液，待管中残留液体彻底干燥后，加入50µl 70% 甲酸，混匀，再加入50µl 乙腈，混匀，以12000r/min 离心2min，吸取上清液。点样移取经上述方法处理后的上清液，与等体积的基质溶液（CHCA）混合，然后涂布于96 孔样品板上，自然晾干后上仪器分析。仪器条件质谱仪器参数如下：正离子模式，检测范围：2000 Da～15000 Da；激光点击数：每图谱 200；激光频率：20 Hz；离子源加速电压：20 kV。每次实验前用校准品对仪器进行质量轴校正。结果Ebio ReaderTM 3700M分析洋葱伯克霍尔德氏菌的质谱图地氯雷他定口服溶液的质谱图地氯雷他定口服溶液+菌的质谱图从口服液质谱图和口服液+菌质谱图对比可知，地氯雷他定口服溶液中不含洋葱伯克霍尔德氏菌。（四）食源性致病菌检测一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌，常见且危害较为严重的食源性致病菌有鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌等。基于Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统，东西分析可提供食源性致病菌高通量、高自动化解决方案，高效地为食源性疾病诊断提供有价值的检测结果。伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌质谱图结 论MALDI-TOF MS是一种非常有前景的微生物鉴定方法，它具有很明显的准确性和高效性，尤其在临床使用中，常规微生物鉴定需要经过较长时间的培养，而且过程比较繁琐，费用较为昂贵。但是MALDI-TOF MS短的可以几秒出结果，而且成本较低，可以更多的惠及患者。

p style=" text-align: justify " strong 微生物检测主要用于辅助诊断，百亿级市场市场空间，潜力很大 /strong /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 你可能知道，“抗生素滥用”在中国很普遍。改变这个现状就要靠微生物检测。2011年卫生部颁布了史上最苛刻的《抗菌药物临床管理办法》，把微生物检测的地位提到了前所未有的高度。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 微生物检测属于IVD的一个细分领域，是对感染性疾病的病原体或代谢物进行检测分析，在临床上通常用于辅助诊断，判断感染类型、指导用药，鉴定环节越准确，诊断结果和治疗方案选择越恰当。如果没有微生物检测，医生倾向于过度用药，或重复试药，可能导致微生物耐药性或病情延误。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 华大基因的一位从业人员认为，临床微生物检测的市场空间达到400亿元。2015年，全球范围内微生物检测占IVD行业份额为18%，在众多细分领域中仅次于POCT，临床对于微生物检测的需求日趋增长。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 我国医疗机构常规临床微生物检测项目有7类，152项，主要包括八大类：真菌、放线菌、螺旋体、细菌、立克次氏体、衣原体、病毒和支原体。其中细菌检测81项，占比为52.5%。 /p p style=" text-align: justify " strong 传统微生物检测方法在检测时间、可检测的微生物数量、灵敏度等方面存在很多不足 br/ /strong /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 目前，微生物实验室使用的检测产品大部分以传统方法为基础。传统检测方法分为染色法、培养法、非培养法三种。目前常用的方法为生化原理检测，先判断革兰式阴性还是阳性，再根据形态、酶反应、显色等不同方法，将具体微生物种类鉴定出来。 /p p style=" text-align: justify " 染色法、培养法是基于传统的涂片镜检，在显微镜下观察变化。培养法的技术是微生物培养、鉴定和药敏检测，也是微生物检测技术中最为重要和成熟的部分。而非培养法是基于酶生化反应，利用微生物繁殖过程中产生的特异性酶与一显色底物发生显色反应而实现检测，主要适用于细菌性阴道病检测。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 对于绝大多数的微生物检测有一个绕不开的环节，那就是标本处理和培养。需要首先对样本进行预处理，根据涂片染色的结果选择合适的培养基分离培养。然后根据菌落特点，选择适当的生化反应或者自动仪器鉴定。药敏检测则采用纸片法或直接上自动化仪器分析。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 只有通过培养得到的各类致病菌，也就是阳性标本，才会做进一步的鉴定和药敏检测。在欧美细菌培养的阳性率在35%左右；根据《中国体外诊断产业发展蓝皮书2015年》发布数据，我国阳性率比较低，只有20%-30%。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 总结下来，传统微生物检测方法有三个方面的问题。一个是样品培养导致检测时间长，传统生物检测时间短到几小时，长到几天都有可能。二是鉴定出来的种类有限，准确度一般。上面已经说过的细菌培养阳性率很低，而且可培养的细菌数量只占病原微生物很小的比例。第三是流程较复杂，离不开人工干预，尤其是样本处理和培养阶段很难用自动化仪器取代。 /p p style=" text-align: justify " strong 基于NGS和质谱的微生物检测技术为行业变革带来契机 /strong /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 基于NGS与质谱技术的微生物检测数据分析方法具有无需预先培养样本、灵敏度高、能够检测未知的微生物的特点，为疾病防控和生物食品安全提供了新的解决方案。 /p p style=" text-align: justify " 二者有几个明显优势：1、速度快，例如质谱的检测时间以分钟计，可实现高通量检测。2、省去样品培养环节，无法培养的微生物也可以检测。目前最多均可检测多达2000余种病原微生物，远高于传统的152种。 3、试剂耗材相对传统使用较少，成本主要是测序仪、质谱仪设备投入。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 不管是NGS还是临床质谱检测，临床应用的探索与开发仅有十年左右。NGS龙头Illumina于2010年推出Hiseq2000 奠定其行业领先地位，同年NIPT开始初步应用于临床，至今NIPT仍然是NGS最成熟的商业化应用。而在临床质谱领域，目前全球应用相对成熟的微生物鉴定，从开发至今也不到十年。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp NGS和质谱的临床应用均未被完全开发，未来仍有较强的平台延展性。基因检测通过对疾病的本质与起源进行检测分析，获得最精确的诊断结果和最合适的治疗方案，临床上可以用于妇幼、肿瘤、遗传病等多个领域。而质谱可以直接对体内各种物质及其代谢产物进行定量检测，全程对疾病的诊断、治疗、预后进行监测，目前已经应用于妇幼、感染、遗传病等领域。基因测序需要通过大数据分析获得结果和疾病的相关性，而质谱需要的则是不断完善数据库，以提高检测结果的准确性。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 目前国内仅梅里埃和BD两家外企，及北京毅新博创的微生物质谱获得CFDA认可。虽然外企大范围市场推广时间较短（约2-3年），市场总装机量不超过400台，但是根据2016年检验医学网的数据，2015年在细菌鉴定和药敏检测中，梅里埃的质谱仪已达到了2%的市占率，增长迅速。总体来看占据主导地位的还是梅里埃和西门子的传统检测系统，目前合并统计后生物梅里埃在细菌鉴定和药敏检测中市占率高达61.1%，西门子紧随其后为26.7%。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 质谱技术在临床微生物菌种鉴定领域的应用，除了技术本身，更重要的是依赖于质谱菌种鉴定数据库。因此，数据库中图谱的质量、数量都将直接影响鉴定的成功率与准确率。由于病原微生物分布流行情况不同，实验室在原有数据库基础上可补充建立本地病原微生物的质谱指纹图谱库，提高鉴定成功率。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 目前梅里埃和BD的产品均可以鉴定2000多种微生物，安图生物在微生物检测领域积累20多年，已开发出具有自主知识产权的中国本土化微生物菌株数据库，可鉴定超过1500种微生物。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 反观NGS在微生物领域额应用，目前全球还没有相关领域的注册试剂获批。国外是通过LDT的方式开展。国内目前处在方法学的标准品验证阶段。由中检院负责，华大基因、博奥生物、达瑞生物和赛哲生物四家公司是第一批参与标准品验证的行业玩家。其中华大基因用自己的BGISEQ测序平台，博奥生物、达瑞生物两家用Thermo Fisher的NGS平台，赛哲生物用的是Illumina平台。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 所谓标准品是行业对NGS方法学，即测序平台的验证。由中检院“出题”，构建一个由1000多种基因组成的样品“黑箱”，四家受试者在各自的平台上分析。检测准确度达到一定标准的，就把这种检测平台作为方法学的标准品，后续可以在这个平台上开发产品。毫无疑问，通过率先通过标准品验证的公司会在行业建立先发优势。 /p p style=" text-align: justify " strong 数据库是微生物NGS、质谱检测的核心壁垒 /strong /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 通过NGS或者质谱平台拿到序列后，面临的一个重要问题就是：选择什么数据库进行比对才能得到较好的分类鉴定结果呢？数据库中图谱的质量、数量都将直接影响鉴定的成功率与准确率。如原核的16S rDNA序列，真核的18S rDNA序列、ITS（ribosomalinternal transcribed spacer）序列等。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 有两个关于人体微生物组的奠基性研究，一个是人类肠道宏基因组计划 MetaHIT，由欧盟发起，8个国家14个研究机构参与。华大基因承担了其中关键的测序与分析工作，从2008年1月1日到2012年6月30日，构建了第一个肠道微生物基因集，包含330万个基因，是近年来肠道微生物研究的里程碑。另一个是由美国国家卫生院发起的人类微生物组计划。从2008年到2013年，采集了人体各个部位共超过5000份样本进行了测序和深入的分析，绘制了人体相关的微生物图谱，并破解了3000种微生物前基因组，初步建立了人体共生微生物参考数据库。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 其实针对每一类生物的主要marker序列都有相应的数据库以方便比对鉴定。如 RDP数据库（RibosomalDatabase Project）、SILVA数据库（一个包含细菌、古菌、真核rRNA基因序列的综合数据库）、Greengenes（针对细菌、古菌16S rRNA基因）数据库、 PR2（ProtistRibosomal Referencedatabase）数据库（针对真核微生物18SrRNA基因）等等。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 由于病原微生物分布流行情况不同，这些公开数据库不能完全满足临床检测需求。实验室在原有数据库基础上需补充建立本地病原微生物的质谱指纹图谱库，提高鉴定成功率。 /p p style=" text-align: justify " & nbsp & nbsp 2016年初，之江生物（834839.OC）发布公告称出资 50 亿韩元，约合 2,750 万元人民币，认购韩国 ChunLab公司390,625 股新增股份,增资后之江生物持有后者 12.93%的股权。ChunLab公司拥有一个庞大的、非公开的微生物数据库。我们预测之江生物的这个布局意味着即将会在微生物检测领域有所作为，也为未来业绩增长创造了很好的先发优势。 /p p br/ /p

培养、鉴定、药敏是微生物检测的三大环节，微生物鉴定在微生物检测中起到承上启下的作用，鉴定的结果不仅可以评价培养结果的成败，还为下一步药敏实验抗生素的选择提供依据，是微生物检测的重中之重。长期以来微生物的快速准确鉴定始终是非常困难的问题，不论是传统的形态学检测还是常用的生化鉴定，其检出率、准确性均不理想，并且结果报告时间较长，临床治疗不得不经验用药，造成了抗生素的滥用，耐药菌泛滥，甚至出现超级细菌。近年来精准医疗的概念越来越收到重视，临床微生物检验迫切需要一种快速、准确的方法确定微生物的种类。质谱的技术的出现及应用，使微生物检测成为现实，使精准医疗迈进一大步。 什么是微生物质谱仪？ 微生物质谱，即基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS） ，其采用软电离技术，特别适合蛋白质等生物大分子的检测，基本原理是将样品分子转化成带电离子，并利用适当的电场磁场实现不同质荷比（m/z）的离子分离，进而检测每种离子的峰强度进行物质分析。 MALDI-TOF MS的性能参数一台微生物质谱仪性能的好坏主要从以下指标评估： 禾信康源MALDI-TOF MS有哪些特点？广州禾信康源医疗科技有限公司在全面掌握质谱仪核心技术和先进制造工艺下，不断改进技术壁垒，创新性的设计了近垂直（5°）激光入射离子源、双脉冲离子延迟引出技术，采用了高性能长寿命固体激光器，使质谱性能和应用范围大幅提高，同时标配国家疾控中心数据库，微生物鉴定结果更具权威性。 近垂直激光入射离子源 双脉冲离子延迟引出技术 仪器分辨率 案例一：空气微生物鉴定2018年8月于某食堂样本采集，一天中采样四次，每次收集3个平板，共计收集12个平板；经培养、分离纯化，最终获得98株纯菌，所得菌株分别使用禾信康源微生物质谱系统CMI-1600、进口某品牌BLT质谱仪、进口某品牌BRT质谱仪及16sRNA测序的结果相比对，CMI-1600鉴定至种属水平禾信康源匹配度可达到87%，分别比进口品牌高15%和10%；结果表明禾信康源CMI-1600微生物质谱的微生物鉴定能力已达到国际领先水平。 鉴定率 广州某检测中（BLT）北京某科学院（BRT）康源（CMI-1600）种水平59%58%74%属水平 77%62%87%案例二：临床微生物鉴定2021年8月云南某医院检验科收集临床菌株282例，使用质谱仪和细菌鉴定仪鉴定结果比对，结果不一致的样本采用第三方仪器验证，结果表明质谱仪鉴定至种、属水平以上菌株279例，准确率可达99%，对比细菌鉴定仪准确率（86%）具有明显优势，且质谱仪数据库菌种范围更广，可以对厌氧菌、丝状真菌进行快速检测。 此外，微生物质谱还可以应用于多种多样的场景，如蛋白组学分析、水环境中微藻类检测、肉类甄别、核酸SNP位点检测、大分子聚合物的分析等等，随着技术的提升以及功能的不断完善，相信在临床检测、科学研究、环境保护等领域微生物质谱的新纪元即将来临！