液相制备色谱法

如果您想鉴定复杂样品中可能有的多种分析成分，那么你对色谱柱的主要要求就是高分辨率。另一方面，如果你想将大量的感兴趣的蛋白质(如生物反应器中产生的基于蛋白质的生物制药)与不需要的化合物分离，那么你对色谱柱的主要需求是产量。　　这就是为什么分析柱倾向于高而薄，而用于大规模分离分析物的制备柱则倾向于更宽，以允许高流速。但是，虽然分辨率对于制备色谱柱的重要性不如对分析柱那样重要，但它仍需要足够高的分辨率，才能将感兴趣的蛋白质与不需要的化合物清晰分离。　　不幸的是，实现所需的分辨率有时可能是相当大的挑战，因为宽的直径允许感兴趣的蛋白质采取各种不同长度的路线通过色谱柱。这将导致蛋白质洗脱成宽带，可能与一些不需要的化合物重叠。　　科学家已经开发了各种技术来提高制备色谱的分辨率。现在拉戈什(Raja Ghosh)和他在加拿大麦克马斯特大学(McMaster University)的同事们提出了一种完全不同的方法，其中包括完全废除色谱柱并用一个盒子替换它。　　他们的想法是用制备色谱中使用的常规离子交换颗粒填充特制的长方形盒子，体积为5mL至50mL。样品和流动相从一端引入盒子的顶部，而被分离的分析物则在相对端流出盒子的底部。这种安排使盒子具有与相同体积的制备柱相似的通量，但感兴趣的蛋白质通过盒子的路径都是相似的长度。　　这是因为蛋白质都需要沿着盒子向下移动相同的距离以达到远端的出口，从而提高分辨率。它们可以先向前然后向下，或先向下然后向前，或沿着任何变化路径迁移，但它们都行进相同的距离，并在窄带中同时洗脱。　　这种新型色谱盒，称为长方体填充床装置，Ghosh和他的团队的对其进行了测试，试图用它分离三种蛋白质的混合物。为了使其具有挑战性，他们选择了三种具有相似等电点的蛋白质：核糖核酸酶A，细胞色素C和溶菌酶，这些都很难分离。事实上，传统的制备柱很难做到这一点，而立方体填充床装置将蛋白质分离成三个清晰的峰。　　他们的立方体填充床装置，所测试的每种效率指标都超过了制备柱。例如，对于分辨率的测量，计算出他们的装置，当流速为每分钟0.5mL时，每单位床高度的理论塔板数为8636 / m，而制备柱的则为1480 / m。　　所以，相当有意味的是，Ghosh和他的团队通过思考如何改进制备色谱的方法，却想出了一个实际上可以取代制备色谱的应用生物制药纯化的盒子。　　原文请参阅：　　Thinking inside the box：A novel alternative to preparative chromatography　　 Published: Apr 9, 2018　　 Author： Jon Evans　　 Channels： Ion Chromatography，separationsNOW.com　　符斌供稿

ISCO 多通道平行和连续快速制备色谱的发明者1950年，创始人Dr. Allington认识到制备液色谱法需要自动收集器，开发了通用于各类色谱的馏分收集器，风靡全球实验室。从此， ISCO不断创新获得多项专利技术，专注于特别是实验室色谱量化制备的应用。早期创新包括开发第一个独立吸光单元的吸光度检测器(AU)，峰检测信号输出控制专利用于馏分收集器，以及专利的高效液相色谱(HPLC)的高压梯度泵，从60-70年代， ISCO推出了适用于低压和高压液相色谱的各种泵和检测器， 20世纪80年代，推出了半自动制备型高效液相色谱系统，包括大容量自动进样器， 90年代末， ISCO发明了自动闪式色谱系统，为小分子化合物的研究发展做出了贡献。ISCO在丰富历史基础上，发明了各种先驱的制备色谱系统，我们聆听用户的心声，保持持续创新的传统，并继续领先未来。 ISCO 制备色谱市场的领导者ISCO一直是闪式色谱设备的市场领导者，销售了成千上万套系统。独家推出了闪式梯度色谱系统，并首先推出了包括平行闪式和顺序闪式系统，全自动大容量系统，和系列检测技术，包括蒸发光散射检测(ELSD)和质谱检测器，覆盖大范围尺寸和分离填料的系列RediSep闪式色谱柱，备受市场尊崇。 ISCO 经过ISO 9001认证的色谱专家ISCO拥有专业团队， ISO 9001垂直一体化生产管理体系，集研究、工程、销售、服务和制造包括塑料成型、机械车间、自动化色谱柱填装和组装操作于一体，是积极进取、关注质量，追求理想的公司。 ISCO 设计理想和宗旨：绿色、环保、节省实验室时间绿色化学和工艺重要原则&ldquo 最大化效率、满足需求、减少过剩"， ISCO设计理念是帮助用户实现这一原则。优化梯度方法最大限度地提高效率，允许在较大的样品装载下进行纯化，最大限度地减少废物输出和溶剂消耗，节省时间。优化梯度消除了超过80%的默认梯度过程的需要，目标化合物没有洗脱到色谱柱或已经被洗脱的情况。减少色谱浪费是创新产品提高生产力的方式，共同改善地球上的生活质量。 ISCO 相关产品快速中低压制备色谱仪系列 CombiFlash® NextGEN系列快色液相制备色谱仪可从制备纯化过程中进行自动识别色谱尺寸和类型，提高制备实验效率，无论是在提纯合成化合物、天然产品、肽或聚合物。直观的PeakTrak软件可在数秒内开始分离。根据要纯化的样品的类型和数量选择正相或反相柱，允许RFID标签载入运行参数，确认检测器设置(UV, Vis, ELS和MS)，按下开始，载入样品，即可开始自动工作，无需人员值守。实验进行时随时更改参数？当分离实验开始时，依然可以修改参数，包括溶剂百分比、波长、流速和运行时间等，不需要进行重复分离。流量300ml和压力300psi允许运行750 g或高达1-2kg的色谱柱以较高的压力极限纯化低溶解度的样品12"或15"智能触摸屏更宽动态范围的检测器改进的基线校正支持使用吸收性溶剂通过简化的用户界面更快地处理节省空间：顶部托盘可容纳四个4L的瓶子改进的梯度曲线可减少多达50%的溶剂 EZ Prep 中压/高压制备色谱一体机 EZ Prep制备系统是一种双重功能的纯化设备，提供了 FLASH 闪式和 Prep HPLC 两种色谱模式无缝切换，灵活和性能的不妥协，应对多样化类型样品分离。闪式色谱，中低压预分离后，对于要进一步提高纯度，从高压分离得到更高分离率和纯度化合物，是非常理想的选择，满足高纯度要求。高压运行HPLC大范围高效液相色谱柱，高压高流速减少运行时间。中压制备液相FLASH和HPLC高压制备液相二合一紧凑空间设计, 自动从正相到反相溶剂的智能切换FLASH中压预纯化4mg-100gHPLC高压精纯化mg-g级，纯度达99%HPLC色谱柱最大直径50mm，填料粒径在5um以下二元梯度流速达200 mL/min，最大耐压: 3500 psiUV, UV/VIS, ELSD和MS等多种检测器可选 ACCQ Prep HP150 高压制备型HPLC色谱系统 HP150直观、易于使用、简单纯化设计理念，用户界面友好，消除了普通高效液相色谱系统中不必要的和复杂的参数设置。提高高效液相制备色谱性能和准确性，提高纯化样品回收率。内置馏分收集器和集成触摸屏，紧凑设计节省空间，HP150系统技术特点：流速1-150 mL/min开发分析方法和制备方法操作压力可达6000 psiUV或UV/VIS基础上选择ELSD和MS检测器一键生成聚焦优化梯度纯化时间最小化，样本回收率最大化 TORRENT 大型纯化制备色谱仪 无人值守大规模自动分离纯化，自诊断系统确保足够溶剂进行纯化和废液溢出；适合各种溶剂器皿和废液排放，专利智能液位技术监测溶剂供应和废液。1 L/min流速、100 psi压力、300g纯化、多功能定制系统，满足各种样品、溶剂、馏分和废物处理设置。大流量泵在1L/min流速即使梯度很小的情况下，可提供准确可靠的、重复性高的二元梯度。性能：1000ml/min 的流速，可快速的分离高达600g的样品。安全：安全性超过了法规的要求，标准配备了流动相系统的压力传感器和仪器周边环境溶剂蒸汽传感器，确保仪器在正常情况下运行，一旦出现异常及时给出报警并停机。多功能性：用户可使用或修改默认的参数，开发自定义的分离程序，同时所有实验参数均可在运行过程中加以更改，可实时控制实验过程（包括点击并拖动修改梯度）。操作简便：使用Peaklrak软件，可以非常直观地在屏幕中了解参数。应用范围：可用于工艺放大、化学研发、生产制造等生产实验。广泛应用于制药、药物化学、天然物质、农用化学、化妆品、香精香料等行业。

在制备液相色谱中，样品的上样量是影响分离效果的重要因素之一。要纯化分离的样品应以合适的浓度添加到色谱柱柱床上，以实现窄的水平谱带。如果上样量太大，则谱带变宽，分离效率降低。Flash和Prep HPLC的上样量有很大不同。由于Flash色谱通常用于预纯化，高分辨率不是优先考虑的因素，因此上样量往往比Prep HPLC高。在Prep HPLC中，主要目的是获得最高纯度的物质，故基线必须得到分离。正相和反相二氧化硅（如C-18、氨基或二醇基）的上样量也存在相当大的差异。由于非键合相二氧化硅的表面积大，故这种固定相的载样能力更高。正相二氧化硅的载样能力通常比键合二氧化硅的载样量高约10倍。标准二氧化硅（粒径40-60 μm）通常可接受10%的载样量；在使用较小颗粒（15-30μm）时可以达到30%。然而，重要的一点我们要知道，无论是反相还是正相，上样量由样品的复杂程度决定的。对于含有多种化合物的复杂样品，决定其复杂性的因素是纯化目标化合物与其邻近的洗脱组分的分离程度。通常情况下，复杂样品需要少量多次的上样方式来处理。接下来“小步”同学将分享给大家一篇关于Pure制备色谱上样量的应用文章，来让大家感受下色谱的魅力。?在液相色谱中，样品可以通过两种不同的方式上样：固体或液体。液体上样，是将样品溶解在溶剂中后，直接注入色谱柱上。固体上样，是将粗样品与载体材料（如硅胶）的固体均匀混合物放在色谱柱前面。图1：液体和固体样品每种技术都有其需要考虑的特殊方面，下面将进行更详细的讨论。液体上样是一种将样品很好地溶解在洗脱初始溶剂中的方法，可用于Flash和Prep液相色谱应用中。推荐使用弱极性溶剂，因为强极性溶剂会降低分离度。液体上样被认为是最简单、最快捷的方法，但可能会造成样品损失，需要考虑的因素如下：- 化合物在初始溶剂中的溶解度:样品需要完全溶解，因为进样系统或色谱柱顶部的沉淀可能在系统中产生过大的压力，并最终导致样品流失。- 溶解溶剂的极性：如果使用极性溶剂溶解样品，则它们可能会吸附在极性硅胶柱基质上，并对更多极性化合物（后来在硅胶材料上洗脱的化合物）的分离产生不利影响。- 样品溶剂的体积:体积越大，样品从一开始就迁移到填料柱床中的风险就越高，从而导致谱带变宽、分离度降低。理想的样品体积不应超过色谱柱体积的10%。样品的保留率越高，可装载的体积就越大。- 样品量：每根色谱柱都有规定的装载量。理想的样品量不应超过纯化柱的最大装载量。在Flash液相色谱中，通常是在注射器的帮助下将液体样品手动直接注入到色谱柱顶部（如下图）。由于高背压，无法在Prep液相色谱柱上进行手动上样。因此，它是通过专用的进样阀完成的，如图所示：图2：Flash和Prep HPLC中的液体上样固体上样是仅适用于Flash色谱分离应用的技术，用于只能在强溶剂中溶解的样品，或用于具有难以溶解的粘性或多杂质样品。该方法可以通过减少谱带展宽和随后的拖尾效应来改善分辨率。一般来讲，固体上样分离较慢，但与液体上样相比，分辨率更高。推荐的样品量不应超过色谱柱的最大载样量。固体上样通常通过以下步骤完成：- 将粗样品溶解在合适的极性溶剂中。-然后，将该混合物在超声浴中超声几分钟，以提高溶解度。- 过滤混合物以除去尚未完全溶解的物质。非键合的二氧化硅是最常用的吸附剂，但可能不是最佳的选择。通常，建议使用与色谱柱相同类型的硅胶作为支撑材料。这样可以避免不必要的化学相互作用或样品的不可逆吸附。一种有用的替代材料是 Celithe,由于其中性的化学特性，它不与任何物质发生相互作用。