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激光共聚焦扫描显微镜简介一、 激光共聚焦显微镜的基本组成激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品,是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置,以及通过针孔的选择和PMT的收集,并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比,它具有更高的分辨率,实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。激光共聚焦显微镜主要有四部分组成:1、显微镜光学系统。2、扫描装置。3、激光光源。4、检测系统。整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。1.1 显微镜光学系统 显微镜是LSCM的主要组件,它关系到系统的成象质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色 差物镜,有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换,滤色片组的选取,载物台的移动调节,焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。1.2 扫描装置 LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围,图象采集速度大大提高,512×512画面每秒可达4帧以上,有利于那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。1.3 激光光源 LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器,发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光,氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光,氦氖红激光器发射波长为633nm的红光,新的405nm半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线,但是小巧便宜而且维护简单。1.4 检测系统 LSCM为多通道荧光采集系统,一般有三个荧光通道和一个透射光通道,能升级到四个荧光通道,可对物体进行多谱线激光激发,样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT,配有高速12位A/D转换器,可以做光子计数。PMT前设置针孔,由计算机软件调节针孔大小,光路中设有能自动切换的滤色片组,满足不同测量的需要,也有通过光栅或棱镜分光后进行光谱扫描功能的设置。二、激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用传统光学显微镜相比,激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率,实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点,在对生物样品的观察中,激光共聚焦显微镜有如下优越性:1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描,可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。2、 可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。3、***图象的获得,如7 维图象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。 4、细胞内离子荧光标记,单标记或多标记,检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。5、荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质,膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体,核酸等观察;可以在同一张样品上进行同时多重物质标记,同时观察; 6、对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性;数据图像可及时输出或长期储存。 由于共聚焦显微镜的以上优点,激光共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛:1、细胞生物学:如:细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡机制;各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析;DNA、RNA含量、利用特定的抗体对紫外线引起的DNA损伤进行观察和定量;分析正常细胞和癌细胞细胞骨架与核改变之间的关系;细胞黏附行为等 2、生物化学:如:酶、核酸、受体分析、荧光原位杂交、杂色体基因定位等,利用共聚焦技术可以取代传统的核酸印迹染交等技术,进行基因的表达检测,使基因的转录、翻译等检测变的更加简单、准确。3、药理学:如:药物对细胞的作用及其动力学;药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 4、生理学、发育生物学:如:膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态;动物发育以及胚胎的形成,骨髓干细胞的分化行为;细胞膜电位的测量.荧光漂白恢复(FRAP)、荧光漂白丢失(FLIP)的测量等。 5、遗传学和组胚学:如:细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断; 6、神经生物学:如:神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递; 7、微生物学和寄生虫学:如:细菌、寄生虫形态结构; 8、病理学及病理学临床应用:如:活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断; 9、免疫学、环境医学和营养学。如:免疫荧光标记(单标、双标或三标)的定位,细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位;对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达,荧光能量共转移(FRET)。
[url=http://www.leica-microsystems.com/cn/%E4%BA%A7%E5%93%81/%E5%85%B1%E8%81%9A%E7%84%A6%E6%98%BE%E5%BE%AE%E9%95%9C/]激光共聚焦显微镜[/url]用于对样品(如贴片细胞)进行荧光成像,一般具有几条不同波长的激光作为激发光,研究人员可根据自身不同的实验需要来选择合适的激光进行荧光成像。共聚焦显微镜相对于传统的荧光显微镜具有极大的优势。首先,激光共聚焦显微镜具有极高的层切能力,可以对样品进行三维成像。与普通荧光显微镜不同,共聚焦显微镜可以对待观察样品的某一平面清晰成像,通过改变样品的垂直位置对样品的不同平面进行依次成像,还可对样品的特定平面进行实时动态成像。其次,共聚焦显微镜相对于传统的荧光显微镜具有极高的分辨率,基本达到了光学显微镜分辨率的理论极限。再次,由于激光共聚焦显微镜基于单点扫描的成像模式,因此可以在此基础上开发出其他传统荧光显微镜不能达成的技术,如荧光漂白恢复技术,荧光相关光谱技术等。共聚焦显微镜在生物学和化学领域具有极其广阔的应用,如对样品的荧光信号进行定性定量分析,对组织样品进行三维结构观察等。
[align=center]激光共聚焦显微拉曼光谱仪使用心得[/align][align=center]NQI研发中心 徐婧婧 [/align]拉曼散射效应是印度物理学家拉曼在1928年首次发现的,随后在法国和苏联也被观察到。拉曼散射是当光通过透明介质时,由于入射光与分子运动相互作用而引起频率的变化。在透明介质的散射光谱中,频率与入射光频率υ[sub]0[/sub]相同的成分称为瑞利散射;频率对称分布在υ[sub]0[/sub]两侧的谱线或谱带υ[sub]0[/sub]±υ[sub]1[/sub]即为拉曼光谱。拉曼散射光频率与入射光频率之差(即拉曼位移)反映了分子振动和转动能级的情况,并且激发光频率对此没有影响,此外在一定条件或状态下不同的物质分子具有独一无二的分子结构,因此拉曼效应可用于鉴别物质。此外,拉曼信号强度正比于分子振动与转动强度,因此也可用作定量分析。如今,拉曼光谱早已是一项成熟的非接触式无损检测技术,并在食品检测、环境监测、珠宝文物鉴定等领域有着广泛的应用。在拉曼光谱测量仪中显微共聚焦激光拉曼光谱仪以其极高的灵敏度成为现代研究工作中一种先进测试手段,其具有对样品无损伤、无需样品制备、分析速度快、信息精确、高灵敏度、高分辨率、高重复性等诸多优点,非常适合各种物质的快速测定和分析,在众多研究领域的材料结构分析中是不可替代的设备。显微共聚焦激光拉曼光谱仪的检测原理为:激光器发出的激光光束通过激光光路传递到显微镜,通过显微镜聚焦到被测样品,激发出频率发生改变的非弹性拉曼散射信号,经过信号光路,并光栅进行分光,然后采用高效光信号采集及处理系统获得全光谱范围内的拉曼散射信号,研究分子的振动能级,从而反应物质的结构信息。还可对选定区域进行点、线、面扫描,从而确定不同物质的成分分布状况。激光共聚焦显微拉曼光谱仪目前的生产厂商主要以进口厂家为主,主要有HORIBA Scentific、Renishaw、Thermofisher等厂家。不过高精度的拉曼光谱仪特别是激光共聚焦显微拉曼光谱仪价格昂贵,为了能够更好的发挥拉曼光谱仪的使用价值,使用时要格外注意操作规范并且在闲置时要对其进行合理的保养。主要注意以下几点:1.为防止仪器受潮而影响使用寿命,拉曼仪器所在实验室应经常保持干燥,即使仪器不用,也应每周开机至少两次,每次半天,同时开除湿机除湿。特别是霉雨季节,最好是能每天开除湿机。2.实验室里的CO[sub]2[/sub]浓度会对仪器寿命造成很大影响,因此实验室里的人数应尽量少,无关人员最好不要进入,还要注意适当通风换气。3. 为减少化学试剂对测定的影响,用于拉曼光谱分析仪的化学试剂应为光学试剂级,至少也要分析纯级。如发现化学试剂出现结块的现象,则应重新加热干燥。4.实验完毕后需要定期对机身进行保养,主要注意清除大颗粒灰尘、清洁镜头、机身。清洁过程中一定要注意使用合适的力道,太轻可能会导致清理不干净,太重又可能不慎损坏机身。以下是实验过程中利用激光共聚焦显微拉曼光谱仪测试的一些数据:[align=center][img=,690,467]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909160934496173_6576_3048281_3.jpg!w690x467.jpg[/img][/align][align=center]图1不同激光强度下4-巯基苯甲酸的拉曼光谱图[/align][align=center][img=,690,467]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909160935033673_5943_3048281_3.jpg!w690x467.jpg[/img][/align][align=center]图2尼尔蓝与4-巯基苯甲酸的双标记纳米粒子拉曼光谱图[/align]