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请问一下,正向高效液相色谱和反向高效液相色谱的区别如何看?
高效液相色谱是分析界应用最广泛的仪器之一。对于高效液相色谱的应用和维护,有许多网友已经写了大量的文章,很值得学习。然而,qignqingcao这次在准备这篇文章的时候,阅读了《系统论》,突然灵感凸显,觉得我们可以用一些理论来解释来研究我们的高效液相色谱。用理论这个工具,让我们更好地认识仪器,从而上升到一个哲学的思考。 为了写这篇文章,我首先推荐一下青青草在2004年写的一篇文章。关于液相色谱一些故障的原因的查阅和排除。http://bbs.instrument.com.cn/topic/2205295_1?order=threadid 在写那篇文章的时候,我也是一种经验性的积累,今天看看,实际上,如果当时用系统观点去看,也许会更有理论性。 言归正传,我们继续用系统论去看高效液相色谱。 我们知道,基本的高效液相色谱分为五大系统:动力传输系统(流动相,泵);进样系统;分离系统(色谱柱);检测系统;数据采集系统。这五大系统,如果拿出一个系统来看,都可以独立形成一个系统,而我们把这五大系统整合在一起,那么就形成了一个大的高效液相色谱大系统。系统论知识告诉我们:凡是系统在一定意义上必定是整体。而系统的整体性并不是各个元素的简单加和。各组成部分和各层次的充分协调和链接,提高系统的整体运行效果。 我们可以看,泵泵出流动相会有好多因素影响。主要包括泵流速,流动相组成,流动相是否干净,流动相组成和样品的联系等等。这些因素都有可能会影响到后续的分析。举一个简单的例子:如果我用的是反相色谱柱,流动相用的是非极性溶剂(二氯甲烷,氯仿,正己烷等)那么就会影响到后续的分析。比方说,流动相在使用前经过滤膜的过滤,那么发生柱压增高的几率就减少。 我们再以进样系统为例:如果进样中有一个小气泡,那么,这个小气泡影响分析的几率会很大。而且这个小气泡在进样者看来是一个小小的问题,但是,通过系统的放大,可能就在检测器和数据采集中会有极大的显现。 这给我们一个很大的启示:系统的整合性并不是各元素的简单加和。如果某一个系统的小小疏忽,就有可能造成整个系统的极大问题。这就是“蝴蝶效应”。所以,我们在做高效液相色谱时候,一点点的马虎,可能引起很大的问题。 系统论知识还告诉我们:一个系统和包围该系统的环境之间通常都有物质、能量和信息的交换。外界环境的变化会引起系统特性的改变;相应地引起系统内各部分相关关系和功能的变化。 我记得当年检测食品中的糖,用的是示差折光检测器。一开始做的时候,总是发现基线很不稳。根本就不能很好地分析。检查了色谱柱,泵,流动相,都没有什么问题。后来,我们发现晚上测试比白天测试,基线要好很多。后来,我们立刻明白了对于示差折光检测器,对于环境是相当敏感的。而恰好头顶有一个空调,空调的运转,引起了气流的变化。而晚上,我们把空调关闭,气流影响就小,基线就变好。后来,我们通过实验,验证了我们的假设。我们就把仪器搬到一间相对封闭的屋子中,这台高效液相色谱的基线极其的好。 又有一个例子。我们单位购买了一台HPLC,放在一个狭长的单独屋子中,但是,在使用这台仪器一段时间后,仪器的电路板烧坏了。找了工程师来,更换电路板,还是在一段时间依然烧坏。尤其在夏天更容易烧坏电路板。这是什么原因呢?我和几位工程师分析了房屋的结构。终于明白了,这个狭长的屋子一面是封闭的。而仪器恰好是放在那个封闭的面。上海的夏天空气湿度很大,空调开的冷,外部的气流进入狭长的半封闭屋子,恰好把气流堵在那个封闭面上。后来,我们购买了一台空气干燥吸收器,每天开启,没到一天,就能够收集到一大桶水。而这台HPLC仪器在添加了一台空气干燥器后,从没有发生相似的故障。 对于使用高效液相色谱,我们还可以发现,一开始用仪器的时候,仪器不是很听话。原因我觉得也是可以用系统论解释。因为HPLC作为一个系统和环境之间的物质,能量,信息交换,需要有一个适应过程。操作者也需要对仪器有一个认识。而当我们用熟悉了仪器,随便怎么用,好像仪器都不会出问题。这就是系统和环境达到了一个正向反馈。 当然,系统论还告诉我们:任何物质的运动过程都包含着无序的热运动和有序的定向运动。一切物质系统都是有序和无序的对立统一。这是系统内耗的普遍性。而我们知道,hplc在用的过程中必定会有系统的内耗问题,也就是突然仪器出现故障。那么这个故障,并不是头痛医头,脚痛医脚。好多原因我们需要用系统的观点去看到。包括大到操作环境问题,小到密封圈问题。漏液问题,气泡问题。检测器污染问题,管路堵塞问题,静电问题等等。问题的产生,需要我们去研究,解决。实际上,对于初学HPLC的朋友们,遇到各种HPLC的问题,就是自己能力提升的一次机会。如果你能够用整体的观点去排查故障,那么,你就有可能掌握如何驾驭HPLC,使得仪器为你所用。 在这个炎热的夏季,qingqingcao的面前只是一台电脑,我已经离开HPLC测试了。写下这些文字,我自己也在回忆以往的点滴。也希望我们的90后的从事HPLC分析的同志们,能够有些启示。
液相色谱柱维护之正向使用、反向冲洗前言: 液相色谱柱是比较昂贵的色谱耗材,正确的使用和维护对发挥色谱柱的最佳性能和延长寿命至关重要。对于新柱的首次使用要平衡活化、按照标签标示的方向使用、保证流动相和样品洁净、在规定pH范围使用等使用注意事项本文就不在此一一赘述,今天我们主要来讨论一下其维护方法。关键词: 色谱柱、维护、柱压、塌陷、冲洗、反向正文: 色谱柱维护是个长期复杂的工作,如果维护得当会得到满意的试验结果,即提高了工作效率,又延长了色谱柱寿命、节约成本。分析色谱柱受损伤的因素发现,填料被污染是最常见的问题。而解决这个问题最有效、方便、省钱的办法就是冲洗色谱柱。现在以大家应用最为常见的硅胶基质键合C18填料的色谱柱为例,如果您的色谱柱前后端筛板是相同的,那么,本文给您的这个建议对您的色谱柱维护将非常实用,即:正向使用、方向冲洗! 色谱柱正常的工作状态即流动相在泵的外力下带着样品流入色谱柱,然后在柱内把样品分离,而后流出色谱柱进入检测器(如下图一)。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012313_320698_1622024_3.jpg图一看似简单的过程却会由于流动相、样品的洁净度不够等原因把污染物带入色谱柱(如下图二),也就是说色谱柱本身的使用就是一个被污染的过程,随着时间越来越长,污染越来越来重,直到报废。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012313_320699_1622024_3.jpg图二 色谱柱最先被污染的部位就是柱前段,即使是添加保护柱或在线过滤器,也只能减少污染,而并不能杜绝污染。随着使用时间的延长,色谱柱长期接受来自一个方向的污染和冲击,会带来两个严重后果:一是柱前段被高度污染,柱压升高等;二是色谱柱头填料塌陷,即由于色谱柱头填料长期接受来自同一个方向的力量冲击造成的松懈,如果不及时修复会来到柱效下降、峰型变差甚至分叉等情况(如下图三)。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012314_320700_1622024_3.jpg图三被污染后得到的试验图谱自然不合我们的要求,如下图四为某样品在柱前段被污染的色谱柱中检测得到的图谱,理论塔板数、拖尾因子都明显下降,并不符合规定。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012314_320701_1622024_3.jpg图四 我们解决这个污染的办法就是冲洗色谱柱,如果您怕麻烦采用正向冲洗,很显然,根据污染物被流动相带出的方向看,污染物会进过整个柱管内的填料,因此这对色谱柱来说又是一次污染的过程。因此我在这里给您的建议是反向冲洗,使污染物经过最小的路线流出色谱柱(如下图五)。如果您在平时试验中使用此方法,不但能快速的把柱前段的污染物冲洗走,还能把由于流动相冲击照成的柱头填料塌陷修复好,并且采用此方法越早对柱子的修复率越高,色谱柱性能也能保持的越长久。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012315_320702_1622024_3.jpg图五经过反向冲洗后,对某样品同样方法检测,图谱明显变好(见下图六)塔板数、拖尾因子都恢复到原来水平。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012315_320703_1622024_3.jpg图六 为保证反向冲洗时二次污染色谱柱,大家一定要保证色谱柱前端的管路、流动相等的洁净度。如不能保证流动相的纯度,建议使用前抽滤。因此,此种方法对于色谱柱的日常维护效果明显,值得大家借鉴!也欢迎大家共同讨论,发表自己看法!