质谱化合物分子量

MALDI-TOF对小分子化合物分子量的快速确认小分子通常指分子量小于1000 Da（尤其小于400 Da）的有机化合物，包括天然产物（生物体合成）及各类人工合成的有机小分子。质谱技术由于可以精确测量各类化合物的质量，被广泛应用于小分子的分子量表征及结构鉴定工作。通常小分子分子量表征常用手段是LCMS，实则MALDI-TOF同样可以用于小分子化合物的分子量确认，且具有更高的效率。MALDI-TOF MS表征小分子分子量的方案特点：1快！每天可分析数千个样品2直接上样分析，无需样品分离3所需样品量较少，单次上样体积只需1 μL以内4除可溶性样品外，还能够分析难溶性样品MALDI-TOF分析小分子的工作流程小分子测试案例分享01各类化合物（原料、物料、产品）分子量及杂质检测在药品、化工品等产品生产过程中，对投入的原料、物料以及终产品进行分子量和杂质检测，是生产质量控制的重要内容。下图中，通过质谱信息可以直接了解寡核苷酸合成原料亚磷酰胺单体的分子量及杂质信息。寡核苷酸合成原料亚磷酰胺单体质谱图02小分子有机合成反应跟踪、产物确认在有机合成中，鉴定反应产物和了解反应进程极其重要。MALDI-TOF MS可以快速测量化合物进行半定量反应跟踪和产物确认。通过化合物单同位素峰的分布，还能轻松识别出溴和氯的存在与否。下图中原料双（氯甲基）苯的信号强度在反应18小时后降低，产物双（溴甲基）苯在反应18小时后强度增加。反应不同时间获得的反应产物的质谱图比较03有机功能材料合成确认有机功能材料包括有机光电材料、有机导电材料、有机磁性材料、有机催化材料等。MALDI-TOF MS可以快速进行有机功能材料的合成确认。下图中，通过样品同位素分布模式及质量数的实际检测结果与理论值的比较，可以准确判断产品合成是否成功。半导体材料及有机发光二极管材料的质谱图04难溶性颜料分子量分析颜料通常不溶于水和一般有机溶剂，常见的颜料包括无机颜料、偶氮颜料、钛菁颜料等。由于颜料的难溶解性，不能使用传统LCMS或GCMS方法进行分子量检测，而MALDI-TOF MS由于不需要分离，分析时不受溶解性限制，可以检测不溶性颜料的分子量，用于鉴别颜料种类或者颜料生产合成质控。难溶性颜料钛菁红的质谱图结语MALDI-TOF MS具有前处理简单、能够快速获取从低分子量到高分子量各类样品的分子量信息，无需分离、不受样品溶解性限制等优点，为医药行业药物发现、有机合成产物确认、化工领域颜料、乳化剂等各类化工产品分子量分析、有机功能材料的合成确认提供快速检测手段。撰稿人：顿俊玲本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

Steve Zulli、Dan Rolle、Ziqiang Wang（博士）、Timothy Martin、Rui Chen（博士）和Harbaksh Sidhu Waters Corporation, Milford, MA, U.S. 应用效益 使用叠加进样模式进行手性化合物纯化证明了质谱引导的Prep 100 SFC系统所提供的收集方案具有多用性和灵活性。大气压条件下的开放床式收集平台在同时使用包括质谱检测器在内的多种检测器进行触发收集时，可提供更高的效率及成功率。 沃特世解决方案 质谱引导的Prep 100 SFC系统，2998型光电二极管阵列(PDA)检测器，3100型质谱检测器，2767型样品管理器MassLynx&trade 软件，FractionLynx&trade 应用管理程序，叠加进样模块 关键词 手性，Prep 100 SFC，叠加进样，质谱引导，开放床式收集 引言 根据FDA的规定1，手性色谱已经成为药物开发早期为通过药理学、毒理学和临床信息准确鉴定单一纯对映体并进行分离的首选工具。 超临界流体色谱（SFC）因其具有更高的效率、更大的通量和更宽的适用性而被证实成为手性化合物分离的一种主流技术。手性SFC越来越受到关注并且其应用范围不断扩大，在一些情况下逐渐成为首选方法。 通常情况下，对映体混合物含有一定数量的杂质，对于常用的叠加进样和基于信号阈值的收集策略而言（例如UV/ PDA检测），这些杂质可降低实际纯化过程的效率。多数情况下，进行一步预净化是必要的，但因存在资金和工作量限制却是不实际的。这需要一种能将对映体与其它杂质鉴别开来的多功能检测方案。除了UV/PDA检测器之外，3100型质谱检测器是一种可广泛用于手性分离的理想选择。 在本应用文献中，展示了质谱引导的Prep 100 SFC系统及其在开放床式平台上进行叠加进样和收集的功能，并被证实是一种手性化合物纯化的有效工具。下文回顾并描述了用于手性分离案例的系统配置和方法。 试验 化学品 CO2由Airgas（Salem，NH，USA）公司提供，并以加压液体的形式在大约1100 &ndash 1300 psi的条件下，通过内置管道供应给质谱引导的Prep 100 SFC系统。甲醇和反式芪氧化物（T SO，MW：196）由Sigma-Aldrich（St.Louis,MO ,USA）提供。 SFC色谱柱 ChiralPak AD-H和ChiralCel OD-H（均为 21 mm x 250 mm、5 &mu m）由Chiral Technologies公司（West Chester，PA，USA）提供。 SFC系统 质谱引导的Prep 100 SFC系统配备一个附加的叠加进样器。 2767型样品管理器配置为一个简化型重复馏分收集器。 方法条件 SFC梯度和流速程序 对于所述的全部数据而言，100 g/分钟的最大总流速与各种等度的改性剂程序配合使用。 质谱检测器的条件 用于各种试验的3100型质谱检测器标准ESI模式使用以下关键参数： 毛细管电压： 3.5 KV 锥孔电压： 40.0 V 二级锥孔电压： 3.0 V 射频透镜电压： 0.1 V 源温度： 150 ˚ C 脱溶剂气温度： 350 ˚ C 脱溶剂气体流速： 400 L/小时 锥孔气体流速： 60 L/小时 0.1%的甲酸-甲醇溶液用作补偿液流进入质谱，以提高电离效率。 数据管理 MassLynx/FractionLynx，第4.1版 结果和讨论 叠加进样模式下的纯化放大 手性分离中通用的最佳做法是利用叠加进样模式进行样品进样和馏分收集，这可实现效率最大化并降低生产成本。 在含有一定杂质的复杂体系中，质谱引导的系统可以鉴定和选择性的收集感兴趣的目标化合物，并正确的忽略不需要杂质。因而，该系统对于手性化合物的SFC纯化，具有高效、适用范围广的特点，并成为手性药物开发的常规主流工具。 我们对质谱引导的Prep100 SFC系统进行了一定的改造，以便将该系统用于手性化合物分离纯化时达到其最大效益，其中包括添加了一个专用进样器并改变了收集床布局以容纳更大的容器，从而可重复收集对映体的馏分。 层叠进样/进样器的启用 Prep 100 SFC系统整合了一个沃特世叠加进样模块，用户选择&ldquo 进样类型&rdquo 并输入叠加进样的总次数以及软件程序中的其它相关参数，如图1和图2所示。以叠加进样的模式，运行一个自定义的进样序列，该进样器可从单一样品容器中抽取多份等量样品。 未使用叠加进样模式时，2767型样品管理器能继续按照&ldquo 样品列表&rdquo 所定义的顺序从样品架上逐个进样单一样品。 图3显示了对一种双峰混合物进行叠加进样后得出的典型色谱图。紫外和质谱对所需物质的检测结果均是正确的，从而确保了通过紫外或质谱触发可进行可靠而成功的馏分收集。在本例中，紫外信号用作收集触发；必要时也可使用质谱信号。 自定义用于单个样品瓶的收集床布局 质谱引导的Prep 100 SFC系统使用2767型样品管理器作为专用馏分收集器。在手性化合物纯化中，由于馏分收集数为两份（或者在某些情况下可能多达四份），因此需要用更大容器及重复式前后收集模式取代一对一模式下的常规类型试管架。 所以，2767型样品管理器可通过定义收集的位置及更大容器而进行定制。从而可对同一个对映体的所有叠加进样序列结果，通过重复式的前后收集方式，收集到相同的收集瓶中。 如图3所示，两种对映体馏分分别被收集进1号瓶（粉红色条带）和2号瓶（绿色条带）。这在2767型样品管理器上以反复模式根据序列内的单一进样管线而完成。这表明使用Masslynx软件和Fractionlynx样品管理器进行样品收集的过程是成功的，并且满足了依据对映异构体对的信号强度水平进行正确鉴定和收集的关键标准。 图4所示，是对一个包含无关杂质峰与对映异构体对的体系进行分离和选择性收集的实例。如彩色条带所示，通过目标化合物的质谱引导，只有两个分离开的目标化合物被收集，而第三个峰（无关的杂质）没有被收集。 MassLynx/FractionLynx AutoPurify&trade 平台拥有众多高级、适用于复杂工作流程的检测和收集算法，例如，使用多种检测器信号进行触发的布尔逻辑算法。如果样品已足够纯净，那么用户可选择使用UV/ PDA进行检测；如果样品包含相当数量的杂质，那么用户可选择使用组合型信号和斜率算法以及特定的目标分子量，以确保得到更纯的收集馏分。 结论 已经证实质谱引导Prep 100 SFC系统在不同药物的开发过程中具有高效、适用性强及用途广的特点。本文所述的质谱引导Prep 100 SFC系统叠加进样和收集的附加特点使其对手性分离具有更强的定制能力，从而可为纯化实验室的色谱分析师带来效益，例如： ■ 多重、多功能检测模式实现了更高的成功率； ■ 基于开放床式平台的相同叠加进样和收集模式简化了 使用方法； ■ 能提供一个遵从行业和政府规定的更安全的实验室环 境。 沃特世质谱引导的Prep 100 SFC系统是一种在药物发现以及其它制备型色谱中进行手性纯化的强有力工具，可满足实现更大产能和更高成功率的需求。 参考文献 [1] http://www.fda.gov/cder/guidance/stereo.htm 关于沃特世公司 (www.waters.com) 50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。 作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。 2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Nature Chemistry上的文章Native mass spectrometry-based metabolomics identifies metal-binding compounds1，文章通讯作者是来自美国加州大学斯卡格斯药学和药物科学学院的Pieter C. Dorrestein教授。生命活动的正常运行离不开金属的帮助，微生物获取金属的一种常见策略是通过生产小分子电离团来结合金属并形成非共价复合物。尽管结合金属的小分子具有各种生理功能和潜在的药学应用，在复杂生物成分（如微生物培养提取物）中找到金属结合化合物仍具有挑战。由于小分子-金属结合位点是多样的，金属结合情况必须通过实验来确定，常用的实验方法有电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、原子吸收光谱（AAS）、X射线荧光光谱（XRF）、紫外-可见吸收光谱和核磁共振（NMR）等方法，这些方法通常通量较低，且在小分子成分不确定和金属种类复杂的情况下无法判断小分子-金属结合情况。为了发现新的小分子-金属复合物，本文开发了一种非靶向LC-MS/MS方法，结合非变性质谱（native MS）和一种新的计算工具离子识别分子网络，通过相关性分析、用户定义的质量差异和MS/MS相似性匹配相关化合物。该方法能够在复杂的生物样品中筛选金属结合化合物，作者把这个方法称为非变性质谱代谢组学。一、非变性代谢组学概念小分子非靶向分析采用的萃取、样品制备和LC-MS/MS方法通常在低pH值、高比例有机相和低金属浓度的条件下，这些条件不利于金属络合。因此作者采用了非变性质谱的实验思路，考察了在较高的pH值下，小分子与金属的结合比例较高，并开发了一个两步非变性ESI-LC-MS/MS工作流程，该流程具备在线柱后pH调节和金属引入的能力（图1），在金属引入后有足够的时间形成小分子-金属复合物。使用MZmine和GNPS中的计算离子身份分子网络（IIMN）来分析数据。该实验流程是作者开发的第二代方法，此前的第一代方法使用的是双管注射泵（double-barrel syringe pump）注射氢氧化铵溶液，随后注射一种或多种金属盐。二代方法与一代的区别在于使用了HPLC二元泵进行乙酸铵溶液的补液过程，使溶剂组成和梯度更稳定。图1. 基于非变性质谱的代谢组学实验流程。二、方法考察作者首先制备了市售的铁载体标准混合物，即耶尔森菌杆菌素（1）、弧菌杆菌素（2）、肠杆菌素（3）、高铁环六肽（7）和红酵母酸（6），编号与图2相对应。标准品通过HPLC分离，然后通过第一代装置进行液相色谱后pH调节和过量（毫摩尔）氯化铁注入，仅在铁注入后观察到每种铁载体的三价铁加合物（图2a）。随后，作者进行了以下的考察：①考察了加和物峰面积呈现铁的浓度依赖性，但不完全与铁载体本身对铁的亲和力相对应，这可能由于每种载体的电喷雾效率不同以及流动相溶液组成的变化，因此作者开发了带有补流泵的第二代装置，可减少由梯度导致的溶剂组成的变化，并将有机溶剂浓度降低约50%。②考察了铁载体与铁的加和是否是非特异性加和，将能与铁结合的高铁色素分子与一系列不能结合铁的其他分子混合，同样实验流程下发现只有高铁色素结合了铁，证明加和物的形成是特异性结合（图2b）。③考察了载体的金属选择性，向载体加入生理水平（微摩尔）的金属混合物，包括铁、铜、钴、镍、锌和锰盐，发现载体对金属的选择性与文献报道一致，例如两种铁载体对铁的选择性都高于其他金属；两个相似的物质的区分，去铁胺B（DFB）可与铜结合，而去铁胺E（DFE）不能。图2. 液相后注入金属法在标准铁载体样品中的测试。接着，作者将此方法应用于谷氨酰杆菌JB182的培养提取物。该微生物是从液体奶酪培养基中分离出来的，而奶酪是一个缺铁的环境。作者利用非变性代谢组学工作流程，从培养提取物中观察到未结合铁的去铁胺E和结合了三价铁的铁胺E。去铁胺E是使用IIMN观察到的唯一结合铁的分子（图3），检测到的其他分子都不是铁结合的。图3. 谷氨酰杆菌JB182培养提取物的非变性代谢组学测试。a. 去铁胺E是使用IIMN观察到的唯一结合铁的分子；b. 标准液相方法鉴定到的去铁胺E大多没有结合金属，其3.03分钟处的MS1为图d；c. 液相后注入铁鉴定到的去铁胺E结合了金属，其3.05分钟处的MS1为图e。作者用同样的方法测试了大肠杆菌Nissle 1917提取物，并在液相后将pH调整为7（模仿大肠杆菌胞质pH），发现了一些结合铁的载体分子（图4a）及其相应的铁复合物（图4b-d），除图4标注的三种，还存在一些yersiniabactin和aerobactin的衍生物也能结合铁，共发现了至少15种额外的铁载体。衍生物的发现也说明了IIMN识别结构相似性的能力，且修饰也通常与生物合成或代谢有关。除了研究生理条件下的铁结合外，作者也尝试鉴定了锌结合分子，因为大肠杆菌Nissle的锌获取机制尚未完全阐明。使用本文的方法，作者发现了yersiniabactin及其许多衍生物也与锌结合，包括HPTzTn-COOH，这种结合也通过NMR进行了辅助验证。由此可推断yersiniabactin通过获取锌来逃避抗菌蛋白对锌的螯合，增强大肠杆菌Nissle在发炎的肠道中繁殖的能力。此外，作者还测试了比大肠杆菌Nissle基因组大十倍的酒用真菌Eutypa lata，也发现了结合铁的分子衍生物（图4e-f）图4. 非变性代谢组学方法用于鉴定细菌和真菌培养提取物。最后，作者将本方法应用到环境样品中，测试该方法是否可以在超复杂样品中识别金属结合化合物。作者分析了2017年6月浮游植物爆发期间在加州海流生态系统中收集的固相萃取的表层海洋样本。表层海水中的溶解有机质（dissolved organic matter，DOM）是十分复杂的样本，在液相后调节pH至8后，鉴定到了软骨藻酸为铜结合分子，与文献报道的一致。IIMN还分析到软骨藻酸以二聚体的形式与铜离子结合（图5），可能以类似于EDTA的构型与铜配位。图5. 非变性代谢组学方法用于鉴定表层海水中的溶解有机质。总结：本文开发的非变性代谢组学方法通过液相后补充金属或调节pH，可以从复杂的样本中识别已知的和新的金属离子载体。1. Aron, A. T. Petras, D. Schmid, R. Gauglitz, J. M. Büttel, I. Antelo, L. Zhi, H. Nuccio, S.-P. Saak, C. C. Malarney, K. P. Thines, E. Dutton, R. J. Aluwihare, L. I. Raffatellu, M. Dorrestein, P. C., Native mass spectrometry-based metabolomics identifies metal-binding compounds. Nature Chemistry 2022, 14 (1), 100-109.