色谱分析实验方法

1.归一化法　　把所有出峰的组分含量之和按100%计的定量方法，称为归一化法。　　各成分校正因子一致时可用该法，该法简便、准确，特别是进样量不容易准确控制时，进样浓度及进样量的变化的影响很小。　　其他操作条件，如流速、柱温等变化对定量结果的影响也很小。GC应用广于HPLC。2.外标法（标准曲线法、直接比较法）　　首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。具体作法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。　　当欲测组分含量变化不大，并已知这一组分的大概含量时，也可以不必绘制标准工作曲线，而用单点校正法，即直接比较法定量。单点校正法实际上是利用原点作为标准工作曲线上的另一个点。因此，当方法存在系统误差时（即标准工作曲线不通过原点），单点校正法的误差较大。因此规定，y=ax+b 。b的绝对值应不大于100%响应值是y的2%。　　标准曲线法的优点：绘制好标准工作曲线后测定工作就很简单了，计算时可直接从标准工作曲线上读出含量，这对大量样品分析十分合适。特别是标准工作曲线绘制后可以使用一段时间，在此段时间内可经常用一个标准样品对标准工作曲线进行单点校正，以确定该标准工作曲线是否还可使用.　　标准曲线法的缺点：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温度，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。另外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），因此对样品前处理过程中欲测组分的变化无法进行补偿。3.内标法　　选择适宜的物质作为欲测组分的参比物，定量加到样品中去，依据欲测组分和参比物在检测器上的响应值（峰面积或峰高）之比和参比物加入的量进行定量分析的方法称为内标法。　　内标法的关键是选择合适的内标物。内标物应是原样品中不存在的纯物质，该物质的性质应尽可能与欲测组分相近，不与被测样品起化学反应，同时要能完全溶于被测样品中。内标物的峰应尽可能接近欲测组分的峰，或位于几个欲测组分的峰中间，但必须与样品中的所有峰不重叠，即完全分开。一般会选择标准物质的同位素物质作为内标物。　　内标法的优点：进样量的变化，色谱条件的微小变化对内标法定量结果的影响不大，特别是在样品前处理（如浓缩、萃取，衍生化等）前加入内标物，然后再进行前处理时，可部分补偿欲测组分在样品前处理时的损失。若要获得很高精度的结果时，可以加入数种内标物，以提高定量分析的精度。　　内标法的缺点：选择合适的内标物比较困难，内标物的称量要准确，操作较麻烦。使用内标法定量时要测量欲测组分和内标物的两个峰的峰面积（或峰高），根据误差叠加原理，内标法定量的误差中，由于峰面积测量引起的误差是标准曲线法定量，但是由于进样量的变化和色谱条件变化引起的误差，内标法比标准曲线法要小很多，所以总的来说，内标法定量比标准曲线法定量的准确度和精密度都要好。4.标准加入法　　标准加入法实质上是一种特殊的内标法，是在选择不到合适的内标物时，以欲测组分的纯物质为内标物，加入到待测样品中，然后在相同的色谱条件下，测定加入欲测组分纯物质前后欲测组分的峰面积（或峰高），从而计算欲测组分在样品中的含量的方法。　　标准加入法的优点：不需要另外的标准物质作内标物，只需欲测组分的纯物质，进样量不必十分准确，操作简单。若在样品的前处理之前就加入已知准确量的欲测组分，则可以完全补偿欲测组分在前处理过程中的损失，是色谱分析中较常用的定量分析方法。　　标准加入法的缺点：要求加入欲测组分前后两次色谱测定的色谱条件完全相同，以保证两次测定时的校正因子完全相等，否则将引起分析测定的误差。

入伏以后，济南天气逐渐炎热，用电负荷持续上升，为确保济南电网安全迎峰度夏，济南供电公司变电检修室早动手、早谋划、早准备，根据电网的负荷分布情况制定了详细的主变绝缘油色谱分析测试计划，严格落实测试计划、规范试验方法，保证试验数据的准确性。 油色谱试验工作主要是分析油中溶解气体， 用于变压器潜伏性故障的检测。作为有效的绝缘监督手段，油色谱试验以其较高的准确度和灵敏度，越来越受到电力系统的重视。为确保迎峰度夏期间变压器能够安 全度夏，试验人员加快对公司110千伏及以上变压器进行油色谱监督工作，他们加班加点，在保证数据可靠性的前提下，全力以赴抓进度，以确保当天的油样及时 试验完毕。试验过程中，他们严格执行标准化作业，根据规程要求逐步操作，并对试验数据进行准确的分析和判断，严把试验质量关。截至7月21日，变电检修室 已完成40台110千伏及以上主变压器的色谱分析测试工作，为开展全年输变电设备状态检修工作打下基础，为电力安全生产和可靠供应的平稳态势保驾护航。

Michael D. Jones、Andrew Aubin、Paula Hong和Warren Potts 沃特世公司（美国马萨诸塞州米尔福德市） 应用优势 1.正交法进行药物杂质分析 2.用于药物杂质分析的 UPC2 方法 3.对杂质采用超临界流体色谱分析符合 ICH 指南和法规要求 沃特世解决方案 ACQUITY UPC2&trade 系统 ACQUITY UPC2色谱柱套装 Empower® 3软件 ACQUITY® SQD质谱仪 关键词 UPC2，药物杂质，稳定性指示方法，降解分析，方法开发，甲氧氯普胺，合相色谱 简介 超高效合相色谱 (UPC2&trade )以亚2 µ m颗粒为固定相，采用超临界流体二氧化碳作为主要流动相成分。合相色谱是一种使用少量溶剂即可实现高速分析的分析工具，尤其是在分析杂质时，相比于反向液相色谱(LC)，合相色谱的正交方法更有利于发现未知杂质。合相色谱的方法开发不同于液相和气相色谱的方法开发策略，后者已经基本成熟。为了简化这个过程，我们需要研究一种系统的方法，用于开发非手性物质的合相色谱方法。 了解药品和药物材料中的杂质分布是一个重要步骤，样品纯度的评估可帮助制药公司在药物开发过程中做出决策，推进药物上市进程。杂质分布将确定供应商所提供原材料的质量、成品的保质期、合成途径和防止伪造的知识产权保护。色谱图的正交对比有助于生产商作出最明智的决策。在本应用纪要中，实验采用ACQUITY UPC2系统分析甲氧氯普胺及其相关杂质。如图1所示，甲氧氯普胺（胃复安）是一种止吐药，可以治疗胃灼热、胃溃疡以及由化疗导致的恶心。方法开发研究了色谱柱和溶剂，以确定优化特异性和峰形的合适方法条件。 图1. 甲氧氯普胺的化学结构。 实验 UPC2条件 系统：配备PDA和SQD检测器的ACQUITY UPC2系统 色谱柱：ACQUITY UPC2 BEH 2-EP 3.0 × 100 mm，1.7 µ m 流动相A：CO2 流动相B：含1 g/L甲酸铵的甲醇/乙腈(50:50)溶液，加2%的甲酸 清洗溶剂： 70:30的甲醇/异丙醇 分离模式：梯度；溶剂B在5.0 min内由2%增加至30%；达到30%后，保持1 min 流速：2.0 mL/min CCM 反压：1500 psi 柱温：50 ℃ 样品温度：10 ℃ 进样体积： 1.0 µ L 运行时间： 6.0 min 检测条件： PDA 3D通道：PDA，200到410 nm；20Hz PDA 2D通道：270 nm，4.8 nm分辨率（补偿500到600 nm）SQD MS：150到1200 Da；ESi+和ESi- 补液流速：不需要 数据管理： Empower 3软件 样品描述 分离度溶液由甲氧氯普胺和八种相关杂质制备而成，将其置于TruView&trade 最大回收样品瓶中等待进样，如表1所示。杂质的浓度为甲氧氯普胺标准品浓度的0.1% w/w。分离度溶液用于色谱分析方法开发。 表1. 甲氧氯普胺杂质标准品、峰的名称、质量数和欧洲药典分类列表。 结果与讨论 系统筛选 方法开发过程对色谱柱、改性剂和改性添加剂进行了系统筛选，以获得最佳分离结果。初始的配置通过四种改性剂对四种UPC2色谱柱进行了筛选。&ldquo 改性剂&rdquo 是强溶剂流动相，有利于洗脱极性较强的分析物。所使用的四种溶剂分别是甲醇、含0.5%甲酸的甲醇、含2 g/L甲酸铵的甲醇和含0.5%三乙胺的甲醇。筛选过程采用溶剂B在5 min内从5%增加至30%，达到30%时保持1 min的常用梯度。总筛选时间仅两个多小时。对比各色谱柱所得峰可以发现，含有甲酸铵的甲醇总体上可提供最好的峰形，如图2所示。方法筛选过程中通过查看ACQUITY SQD提供的质谱图实现峰跟踪。对于极性较强的分析物，选择性(&alpha )有很大不同。在这些对比实验中，流动相保持恒定，因而不断变化的&alpha 是由[固定相 &ndash 溶质]相互作用所导致。 图2. 色谱柱筛选结果。改性剂(B)是含有2 g/L甲酸铵的甲醇。溶剂B在5 min内从5%增加至30%，达到30%时保持1 min。 基于这些结果，UPC2 2-EP固定相是最佳的色谱柱选择，可以为大多数分析物提供更好的峰形和分离度。UPC2 CSH Flouro-Phenyl色谱柱可以提供较好的选择性和峰形；但是，杂质C未能按预期分离成两个峰。这种未知现象将在未包括在本应用纪要中的另一组实验中进一步考察。1 梯度斜率的影响 在反相LC中，梯度斜率是控制选择性和分离度的常用工具。使用UPC2 2-EP固定相，延长总的梯度运行时间可以降低梯度斜率。斜率的改变对色谱图基本没有影响，仅使峰6和7之间的选择性发生改变，如图3所示。 图3. 归一化的x轴叠加显示甲氧氯普胺，采用延长的12 min和35 min梯度运行时间，其斜率较6 min的筛选实验更小。使用原始梯度；溶剂B由5%增加至30%。 不同洗脱溶剂的影响 使用变化率较平缓的梯度并未增加峰与峰之间的分离度。为提高分离度，将低极性非质子有机溶剂（乙腈）与甲醇（极性较强的洗脱溶剂）以不同比例混合。乙腈的添加提高了分离度，扩展了峰之间的分离间隔。这些现象证明本方法可在方法开发中发挥重要作用，如之前发表的结果所示。1 图4. 如叠加图中突出部分所示，在改性剂成分中添加乙腈后，后部洗脱分析物的分离度明显提高。 在添加剂筛选过程中，我们也考察了每种杂质各自的标准品。甲酸可以优化杂质H的峰形；但是，它会影响其它相关物质的色谱分析性能。添加剂的浓度也会对峰形产生影响。为了得到更理想的峰形，浓度需要高于反向LC的常用浓度。增加甲酸的浓度可以进一步改善杂质H的峰形，如图5所示。但是，杂质F的峰形受到了影响，如图6所示。组合使用甲酸和甲酸铵可同时获得两种添加剂的优势，使全部的分离均获得最佳峰形。在改性剂中使用添加剂甲酸和/或甲酸铵对过期样品进行分析所得结果如图7所示。在此对比实验中使用过期样品使我们能够更好地评估已知杂质在存在未知杂质条件下的选择性和峰形。如图7所示，解决峰形问题最终会影响色谱分离的效率、分离度和灵敏度。 图7. 过期甲氧氯普胺样品的分析，改性剂中分别添加不同的添加剂成分。将甲酸铵和甲酸组合，称之为&ldquo 类缓冲液&rdquo 系统，此系统可使样品中的所有分析物均获得最佳峰形。所使用的改性剂为50:50的甲醇/乙腈。 评估特异性 在确定可对选择性、分离度和峰形产生积极影响的方法条件后，各变量同时获得了优化。实验使用甲氧氯普胺和杂质（对照）的标准混合物和过期的样品混合物对最终方法进行了评估，如图8所示。有关未知杂质的进一步考察，请参阅沃特世（Waters® ）应用纪要。2 图8. 采用&ldquo 实验&rdquo 部分中列出的最终方法条件对甲氧氯普胺对照混合物和降解混合物进行的对比分析。 结论 本实验使用ACQUITY UPC2系统成功对甲氧氯普胺及其相关物质进行了非手性分析。了解杂质结构的特性有利于方法开发。实验中分析的多种杂质包括胺类、羟基、酯类和羧酸。能够影响选择性、分离度和峰完整性的主要方法变量分别是固定相、改性剂的洗脱强度和添加剂的组成。最后甲氧氯普胺相关物质的分析方法展示了此方法对过期甲氧氯普胺样品的特异性。 本方法开发过程通过色谱柱筛选处理中的对比实验揭示了多种[固定相 &ndash 分析物]相互作用。更多的相互作用需要在已发表的研究基础3-6上进行进一步的探索。了解这些方法变量相互作用的影响将有助于创建一种更加适用的方法开发技术。 参考文献 1. Jones MD, et al.Analysis of Organic Light Emitting Diode Materials by UltraPerformance Convergence C hromatography Coupled with Mass Spectrometry (UPC2 /MS).Waters Application Note 720004305EN.2012 April. 2. Jones MD, et al.Impurity Profiling Using UPC2 /MS. Waters Application Note 720004575EN.2013 Jan. 3. West C, Lesellier E. A unified classification of stationary phases for packed column supercritical fluid c hromatography.J Chromatogr A. 2008 May 1191(1-2):21-39. 4. West C, K hater S, Lesellier E. C haracterization and use of hydrophilic interaction liquid c hromatography type stationary phases in supercritical fluid c hromatography.J Chromatogr A. 2012 Aug 1250:182-95. 5. Lesellier E. Retention mec hanisms in super/subcritical fluid c hromatography on packed columns.J Chromatogr A. 2009 Mar 1216(10):1881-90. 6. Zou W, Dorsey JG, C hester T L. Modifier effects on column efficiency in packed-column supercritical fluid c hromatography.Anal Chem.2000 Aug 72(15):3620-6.