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基因组(genome)包含的遗传信息经转录产生mRNA,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组(transcriptome)。很显然,不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。mRNA经翻译产生蛋白质,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。同理,不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类也不尽相同。蛋白质是基因功能的实施者,因此对蛋白质结构,定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。生命科学是实验科学,因此生命科学的发展极大地依赖于实验技术的发展。以DNA序列分析技术为核心的基因组研究技术推动了基因组研究的日新月异,而以基因芯片技术为代表的基因表达研究技术为科学家了解基因表达规律立下汗马功劳。在蛋白质组研究中,二维电泳和质谱技术的黄金组合又为科学家掌握蛋白质表达规律再铸辉煌。蛋白质组学(proteomics)就是指研究蛋白质组的技术及这些研究得到的结果。蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同,对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。蛋白质组学的研究内容包括:1.蛋白质鉴定:可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术,利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。2.翻译后修饰:很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化,糖基化,酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式,因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。3.蛋白质功能确定:如分析酶活性和确定酶底物,细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。4.对人类而言,蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康,主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质,而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。在基础医学和疾病机理研究中,了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子,进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的,因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。可以利用免疫组织化学技术达到这个目的,但该技术的致命缺点是通量低。LCM技术可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型,因此LCM技术实际上是一种原位技术。取出的细胞用于蛋白质样品的制备,结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线,可以对蛋白质的表达进行原位的高通量的研究。很多研究采用匀浆组织制备蛋白质样品的技术路线,其研究结论值得怀疑,因为组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起,最后得到的研究数据根本无法解释蛋白质在每类细胞中的表达情况。虽然培养细胞可以得到单一类型细胞,但体外培养的细胞很难模拟体内细胞的环境,因此这样研究得出的结论也很难用于解释在体实际情况。因此在研究中首先应该将不同细胞类型分离,分离出来的不同类型细胞可以用于基因表达研究,包括mRNA和蛋白质的表达。LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。可以根据需要制备总蛋白,或膜蛋白,或核蛋白等,也可以富集糖蛋白,或通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。相关试剂盒均有厂商提供。蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同,可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品,然后在同样条件下进行二维电泳,染色后比较两块胶。也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记,然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离,最后通过荧光扫描技术分析结果。胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像,然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析,并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统,可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化,酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面(MALDI-TOF)。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析,从而得到蛋白质的定性数据;这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。实际上像人类的血浆,尿液,脑脊液,乳腺,心脏,膀胱癌和磷状细胞癌及多种病原微生物的蛋白质样品的二维电泳数据库已经建立起来,研究者可以登录www.expasy.ch/www/tools.html等网站进行查询,并和自己的同类研究进行对比分析。Genomic Solution可以为研究者提供除质谱外的所有蛋白质组学研究工具,包括二维电泳系统,成像系统及分析软件,胶切割系统,蛋白质消化浓缩工作站,点样工作站等;同时还可以提供相关试剂和消耗品。LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线,除此以外,LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。即通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型,制备细胞蛋白质样品,蛋白质经荧光染料标记后和抗体芯片杂交,从而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。Clontech最近开发了一张抗体芯片,可以对378种膜蛋白和胞浆蛋白进行分析。该芯片同时配合了抗体芯片的全部操作过程的重要试剂,包括蛋白质制备试剂,蛋白质的荧光染料标记试剂,标记体系的纯化试剂,杂交试剂等。对于蛋白质相互作用的研究,酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。Clontech开发的酵母双杂交系统和NEB公司开发的噬菌体展示技术可供研究者选用。关于蛋白质组的研究,也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯片,这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究,蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。Science,Vol.293,Issue 5537,2101-2105,September 14,2001发表了一篇关于酵母蛋白质组芯片的论文。该文主要研究内容为:将酵母的5800个ORF表达成蛋白质并进行纯化点样制作芯片,然后用该芯片筛选钙调素和磷脂分子的相互作用分子。最后有必要指出的是,传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质,而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此蛋白质组学的研究通常是高通量的。适应这个要求,蛋白质组学相关研究工具通常都是高度自动化的系统,通量高而速度快,配合相应分析软件和数据库,研究者可以在最短的时间内处理最多的数据。
蛋白质化学与蛋白质组学夏其昌 曾嵘 等编著2004年4月出版ISBN 7-03-012401-4/Q.133116开,平装,580页定价: 75.00元 本书系统论述了蛋白质化学基础理论和实验技巧,也反映了蛋白质组学研究的最新成果。内容包括:蛋白质的表征,蛋白质的组成分析和序列测定,与此相关的实验方法,包括各种色谱、电泳、质谱技术等,以及应用在蛋白质表征研究和基因工程产品的质检方面的实际范例。在蛋白质组学领域介绍了基本概念、样品制备、双向凝胶电泳的图像分析和定量分析、质谱等常规方法,并介绍了国际上最新的多维技术在研究中的应用;同时充分体现了生物信息学在蛋白质组研究中的重要性。 本书可作为生物学、医学、化学专业大学生,研究生和教学人员的参考书,也是从事生物化学、分子生物学、医学等领域中分离分析工作人员的参考书。
质谱与蛋白质组学蛋白质组学对一个细胞或组织所表达的蛋白质进行的系统分析,而质谱是它的关键性分析工具。在过去的两年中,标准蛋白质组技术中的进展增进了更高水平自动化和敏感性的蛋白质识别技术。另外,新的技术促成了鉴定蛋白质功能相关特性的里程碑性的进展,包括它们的定量和在蛋白质复合物中复杂情况。缩写2DE two-dimensional gel electrophoresis双向凝胶电泳CID collision-induced dissociation碰撞诱导的解离ESI electrospray ionization电喷雾离子化FT-ICR Fourier-transform ion cyclotron resonance傅里叶-变换离子回旋加速器共振ICAT isotope-coded affinity tagsIEF isoelectric focusing等电聚焦MALDI matrix-assisted laser desorption ionization基质辅助的激光解析离子化Q-TOF quadrupole-TOFRP reversed phase反向TOF time-of-flight飞行时间简介蛋白质组学的核心组成是系统识别一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质,以及确定每个蛋白质的突出特征(比如,丰度、修饰状态以及在多蛋白质复合体中的复杂状态)。这些分析的技术包括分离蛋白质和肽的分离科学、识别和定量分析物的分析科学和数据管理和分析的生物信息学。它的初步工具包括使用IEF(等电点聚焦)/SDS-PAGE凝胶的高分辨率的双向凝胶电泳(2DE),结合质谱和数据库搜索来分离、识别和定量在一个复合样本中存在的个体蛋白质,最终识别被分离的蛋白质。一个常用的方法用在Fig1中用图解说明。此技术以及由此而来的变化(综述见[1])已经被用来识别和分类在复杂样本中存在的大量蛋白质,并在蛋白质组数据库中呈现它们,该过程我们这里称之为"描述蛋白质组学"比如,Shevchenko等[2]从2D凝胶上系统地鉴定了150个蛋白质。数目庞大的这样的数据库现在可以找到。同样的技术现在已经被作为普遍的发现工具来动态检测一个细胞或组织对外来或内部干扰反应而在蛋白质组中的改变。因为检测动态改变需要精确定量每个被检测成分,我们使用"定量蛋白质组学"来定义。在此报告中,我们总结了自1999年1月至2000年4月来报道的与蛋白质组学和质谱相关的最重要的进展。在核心质谱技术中的进展已经导致2DE为基础的蛋白质组学技术的进一步改进。它们同时又促进了传统凝胶为基础的方法的替代方法,诸如引入以同位素稀释理论为基础的精确蛋白质定量技术和蛋白质复合物的系统分析。蛋白质组分析的MS技术进展在此部分,我们总结了在MS设备、它们的控制和操作中的进展,以及比较质谱数据和序列数据库识别蛋白质所用的搜索工具的进展。随着新型质谱仪的引入,蛋白质组学研究现存类型的质谱仪性能已经显著改进了。在此综述期间最普遍使用的仪器是可以分为两类:单一阶段的质谱仪和串联质谱为基础的系统。单一阶段的质谱仪,最显著的是基质辅助的激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)仪器,被用于无数通过肽质谱图谱技术大规模蛋白质识别的项目中。此方法在鉴别表达自小一些的和完全测序的基因组的蛋白质特别成功[3,4]。串联质谱仪器诸如triple quadrpole、离子捕获(ion-trap)和近来引进的混合quadrupole飞行时间(Q-TOF)被常规应用于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS或用电喷雾电离(ESI)来生成肽片段离子谱,以便通过搜寻序列数据库进行蛋白质鉴定。使用仪器控制程序来自动选择肽离子进行碰撞诱导的解离(CID)(数据依赖CID)的不断增多是这些MS/MS仪器的一个明显的趋势。一些新的构造的具有高潜能的质谱仪被引入到蛋白质组学研究中产生深刻影响。两个研究组近来一个MALDI离子源和一个混合Q-TOF耦联了起来[5,6]。Q-TOF提供的质量准确性和敏感性提升了数据库搜寻结果并同时使它成为MS/MS从头测序的当然仪器选择。MALDI Q-TOF构造提供了激动人心的机会进行自动化和高通量应用以及在一个样品盘上存档样品进行日后研究的可能。Medzihradszky等[7]描述了一个不同的混合仪器称之为MALDI TOF TOF。此设备享有许多MALDI Q-TOF的优点,另外能够进行高能量CID和非常快速的扫描速率。傅里叶-变换离子回旋加速器共振(FT-ICR)质谱对于蛋白质组学来说相对陌生。这些设备具有非常高的敏感性和分辨率,质量精确性可以达到1ppm。这些特征被用来在一次分析中测量和定量几百种蛋白质的完整的分子质量[8]。Goodlett等[9]表明FT-MS测量的一个肽的准确质量以及可以容易获得的限制因素能够通过序列数据库搜索被用来识别蛋白质。蛋白质组学如果没有软件工具来进行质谱数据和序列数据库的关联将变得几无可能。现存的数据库搜索程序已经变得越来越成熟和可以(从网络)可获得。另外,引入了新的算法。主要相关程序是Sequest[10],MASCOT[11],PeptedeSearch[12],PROWL[13]和Protein Prospector[14]。在它们中间,Sequest使用CID谱设置了蛋白质识别的实验室标准(benchmark),因为它与边界MS/MS数据工作得最好,并高度可信,可以从整个[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS实验中自动分析数据,并不需要任何使用者的破译工作。在所提的程序中,然而,只有Sequest不能在网络上搜索。MASCOT是一个新的、快速、网络可进入和多功能的程序,具有进行肽指纹分析、用部分破译或未破译的CID谱进行数据库搜索的功能。