电动荧光变倍显微镜

最近，有不少小伙伴说使用荧光显微镜太麻烦了，需要提前开汞灯进行预热，需要手动更换滤光片，荧光特别容易淬灭，稍微厚一点的样本拍出来的效果特别不好。为什么使用荧光显微镜会如此不方便呢？今天我们就来一探究竟。说到荧光显微镜首先想到的问题就是荧光光源及滤色块。这是为什么呢？所有的一切都要从荧光观察的原理说起。不管是自发荧光还是荧光染料，它们发光的原理是一致的，都是吸收某一波段的光，提高自身的能量，然后再以特定的波段将能量以光的形式对外释放。正是因为荧光成像的特殊性，显微镜荧光成像过程中对光源要求很高，需要通过滤色块对光源进行过滤，这样势必导致光源能量的损失，因此这就对荧光光源的能量有着很高的要求。传统的光源有汞灯、氙灯，它们可以为荧光观察提供足够的能量，正是因为其高能量的特性，必然伴随着很多不可避免的缺陷：1、能量高，功率大，需要预热与预冷。这就极大的增加了使用者的时间成本，同时极高的功率降低了使用寿命，增加了使用成本。2、高能量光源需要在稳定极高电压下被激发，因此光强不能随意调节，需要通过添加挡光片进行调节。这就意味着传统荧光光源强度不能根据需求在任意强度进行调节。3、高能量的状态存在爆炸的可能性，具有一定使用风险，同时容易对观察的样品产生较强的光毒性。随着科技的发展尤其是高能LED的诞生，越来越多的荧光显微镜开始使用高能LED作为显微镜的荧光光源。因为其可以固定发射某一波段的光，所以通过滤色块损失的能量极少。这就意味着LED作为荧光光源，既可以克服传统光源的缺点，又保证了荧光观察所需强度。那么有没有操作便捷的荧光显微镜呢？答案是：必须有的啦。Revolve Generation 2正倒置一体电动荧光显微镜，带你解锁不一样的荧光观察技能。Revolve Generation 2正倒置一体电动荧光显微镜就是采用高能LED光源，开关在毫秒间，可以大大减少样品在光照下的暴露时间。光源一致性好，寿命长，即开即用，光毒性低，对活细胞样品非常友好。针对不同的荧光染料，需要使用合适的滤光片来捕捉荧光信号。在不同荧光通道的切换方面，Revolve Generation 2正倒置一体电动荧光显微镜是一键自动切换。针对需要进行多重荧光观察的样品，为了更加迅速的对脆弱的荧光样品进行捕捉，Revolve Generation 2正倒置一体电动荧光显微镜搭配自动荧光系统，多通道荧光自动切换，自动多通道图像叠加，体验感极佳。最后在图像采集方面，Revolve Generation 2正倒置一体电动荧光显微镜采取双相机模式荧光明场自动切换，荧光样品通过单色相机进行成像，确保了其最佳的采集方式。（关于荧光为何选取单色相机详见本公众号的-如何用显微镜拍出良好的照片。）以上就是Revolve Generation 2正倒置一体电动荧光显微镜对荧光观察的解决方案，简单又实用。你以为这就结束了？不！最好的要留在后面。针对成像条件复杂的样本，Revolve Generation 2正倒置一体电动荧光显微镜也给出了教科书级别的解决方案，简直亮瞎了双眼。通过Z-Stacking软件控制Z轴马达电机对样品进行Z轴层扫，获得不同聚焦平面的图像并自动整合为大景深的立体图像，获得超过二维平面效果的三维立体图像，显著提升较厚样品的图像质量。独有的DIGITAL HAZE REDUCTION实时数字化图像处理功能，增加宽场荧光显微镜图像锐度，抑制噪声减少模糊，提高荧光检测分辨率，清晰展现样本细微结构，颠覆传统成像效果。

荧光显微镜的软件界面让你伤透脑筋，不知该怎么调整？荧光通道切换需要调整的东西太多，切换时总出错？观察时间太长，眼睛总是盯着目镜酸涩难忍?如果你有这些烦恼，那就来试试Revolve Generation 2正倒置一体电动荧光显微镜吧。Revolve Gen2化繁为简，功能整合，明场、荧光、正置、倒置四位一体；并且采用流畅智能的拍摄软件，进一步可叠加DIGITAL HAZE REDUCTION（DHR）实时数字化图像处理功能，增加宽场荧光显微镜图像锐度，抑制噪声减少模糊，提高荧光检测分辨率；可通过精确Z-Stacking功能实现全景深样品观察，较厚样品荧光检测效果出众。Revolve Generation 2正倒置一体电动荧光显微镜采用交互式设计的智能电动荧光系统，实现毫秒级荧光自动切换，即保证成像质量又可保护用户样本。便捷的一键控制解决了荧光观察前的繁琐调试。同时可以一键切换相机系统，独特的双相机配置，实现了明场和荧光的一键切换和匹配拍摄。宽场荧光显微镜荧光拍摄清晰度不够，共聚焦拍摄速度又太慢，而且荧光容易淬灭，是否可以加快拍摄速度，避免荧光淬灭，同时可以得到足够清晰的图片？是否实现较厚样本的快速超高清全景深观察？Revolve Generation 2正倒置一体电动荧光显微镜将实现您的想法☑ 独有的实时DHR数字降噪技术，通过数字化图像处理，在镜下实时显示高分辨图像，清晰展现样本细微结构，颠覆传统成像效果。☑ Z轴高精度自动层扫，配合实时DHR数字降噪技术，在保持高分辨率的同时，对较厚样本进行全景深扫描合成，实现全景深观察。新一代Revolve正倒置一体电动荧光显微镜，拥有流行的触屏操控方式，配备智能荧光成像系统，将Z-Stacking全景深成像和DHR数字处理功能有机联合，提升分辨率告别照片模糊，为您打造全新的成像体验。

2014年诺贝尔化学奖授予了荧光超分辨显微技术，利用荧光分子的化学开关特性（PALM/FPALM/STORM）或者物理的直接受激辐射现象（STED），实现超越衍射极限的超分辨成像。尽管如此，活细胞中的超分辨率成像仍然存在两个主要瓶颈：（1）超分辨率的光毒性限制了观察活细胞中精细生理过程；（2）受限于荧光分子单位时间内发出的光子数，时间和空间分辨率不可兼得。受限于这个瓶颈，为了在活细胞上达到60 nm空间分辨率极限，现有超分辨率成像手段需要强照明功率（kW~MW/mm2）、特殊荧光探针和长曝光时间（ 2 s）。强照明功率引起的强漂白会破坏真实荧光结构的完整性，长曝光时间在图像重构时导致运动伪影，降低有效分辨率。迄今为止，基于光学硬件或者荧光探针的改进无法进一步提升活细胞超分辨率的时空分辨率，实现毫秒尺度60 nm的时空分辨率成像。2021年11月16日，哈尔滨工业大学李浩宇教授团队与北京大学陈良怡教授团队合作在Nature Biotechnology上发表论文Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy【1】。他们另辟蹊径，发明基于新计算原理的荧光超分辨率显微成像，进一步拓展荧光显微镜的分辨率极限。通过提出“荧光图像的分辨率提高等价于图像的相对稀疏性增加”这个通用先验知识，结合之前提出的信号空时连续性先验知识【2】，他们发明了两步迭代解卷积算法，即稀疏解卷积（Sparse deconvolution）方法，突破现有荧光显微系统的光学硬件限制，首次实现通用计算荧光超分辨率成像。结合自主研发的超分辨率结构光（SIM）系统，实现目前活细胞光学成像中最高空间分辨率（60nm）下，速度最快（564Hz）、成像时间最长（1小时以上）的超分辨成像。结合商业的转盘共聚焦结构光显微镜，实现四色、三维、长时间的活细胞超分辨成像。1、应用举例：DNA折纸标准样本验证为了在已知结构样本中验证分辨率的提升，研究者设计并合成了两个荧光标记位点的DNA折纸样本，每个位点用4~5个Cy5标记。当这些分子间距为60 nm、80 nm和100 nm时，它们在TIRF-SIM下几乎无法区分，但在经过稀疏解卷积重建后（Sparse-SIM，图1）可以很好地区分它们中间的距离。整体结果可以用单分子定位显微镜ROSE【3】交叉验证，与Sparse-SIM得到的DNA折纸的荧光对间距以及不同间距荧光对在玻片上的分布一致。图1：Sparse-SIM解析不同距离DNA折纸样本。（a）在相同视场下，用配对Cy5标记不同距离（60 nm, 80 nm, 100 nm, 120 nm）的DNA折纸样品，用TIRF（左）、TIRF-SIM（中）和Sparse-SIM（右）成像。（b）在TIRF、TIRF-SIM和Sparse-SIM下，黄色（60 nm）、蓝色（80 nm）(80 nm)、绿色（100 nm）和红色（120 nm）框包围的放大区域。比例尺：（a）2 μm；（b）100 nm。2、应用举例：Sparse-SIM超快活细胞成像揭示核孔结构和胰岛素囊泡早期融合孔道在活细胞成像中，稀疏结构光显微镜（Sparse-SIM）可以解析标记不同核孔蛋白（Nup35, Nup93, Nup98，或Nup107）的环状核孔结构，而它们在传统结构光显微镜（2D-SIM）下形状大小与100 nm荧光珠类似（图2c, 2d）。由于相机像素尺寸与孔径直径类似，测量的核孔拟合直径与Sparse-SIM的分辨率相当。校正后Nup35和Nup107孔的直径分别为~66 ± 3 nm和~97 ± 5 nm，而Nup98和Nup93直径大小处于这个范围中（图2e, 2f），结果与以前用其他超分辨成像方法在固定细胞中获得的直径相符【4】。有趣的是，12分钟超分辨成像可以显示活细胞中核孔形状变化，这可能反映了核膜上的单个核孔复合物动态重新定向到焦平面或远离焦平面（图2g），这是其他超分辨方法难以观察到的。图2：Sparse-SIM解析核孔蛋白动态过程。（c）用Sparse-SIM观察活COS-7细胞中以Nup98-GFP标记的动态环状核孔的典型例子，持续时间超过10分钟。上下区域分别显示2D-SIM和Sparse-SIM下的图像。（d）比较（c）中青色框中的核孔结构快照与100 nm荧光珠在不同重建方法（2D-SIM、20次RL解卷积后、50次RL解卷积后、Sparse-SIM）下的结果。（e）由于核孔的大小与Sparse-SIM的分辨率和像素大小相当，按照Supplementary Note 9.1的协议（详情请见文章），分别推导出Nup35-GFP（红色）、Nup98-GFP（黄色）、Nup93-GFP（绿色）和Nup107-GFP（青色）标记的核孔结构的实际直径。（f）Nup35（66 ± 3 nm, n=30）、Nup98（75 ± 6 nm, n=40）、Nup93（79 ± 4 nm, n = 40）、Nup107（97 ± 5nm ,n = 40）的平均直径环。左右两幅蒙太奇分别为传统Wiener重构或稀疏解卷积后的结果。（g）在6个时间点对 （c）中的品红色方框放大并显示。比例尺：（c）500 nm；（d, g, f）100 nm。通过滚动重建，Sparse-SIM的时间分辨率可达564 Hz，识别出来INS-1细胞中VAMP2-pHluorin标记的、更小的胰岛素囊泡融合孔道（如~61 nm孔径）。它们在囊泡融合的早期出现，孔径小（平均直径~87 nm），持续时间短（9.5 ms），不能被之前传统的TIRF-SIM所识别【2】。另一方面，鉴别出来的稳定融合孔在囊泡融合的后期出现，孔径大（平均直径~116 nm），持续时间长（47 ms），是之前看到的结构【2】。值得一提的是，虽然这里发现的囊泡早期融合孔状态很难被其他的超分辨率成像手段所直接验证，但是它们的发生频率与30多年前用快速冷冻蚀刻电子显微镜所观察到的“小的融合孔发生概率远低于大的融合孔”现象相吻合【6】。3、应用举例：稀疏解卷积是提升荧光显微镜分辨率的通用方法与当下热门的深度学习超分辨率显微重建不同，信号的空时连续性、高空间分辨率导致的荧光图像相对稀疏性这两个先验知识，是荧光显微成像的通用先验知识，不依赖于样本的形态以及特定的荧光显微镜种类。因此，稀疏解卷积是通用荧光显微计算超分辨率成像算法，可被广泛应用于提升其他荧光显微模态分辨率，观察不同种类细胞器的精细结构及动态（图3）。图3 | 稀疏解卷积广泛应用于提升不同显微成像模态空间分辨率，揭示各类细胞器精细结构动态。比如稀疏解卷积增强的商业超分辨转盘共焦结构光显微镜（SD-SIM）【7】，可以实现XY方向90纳米，Z方向250 纳米的空间分辨率，清晰记录分裂期7 μm深度内的全细胞内所有线粒体外膜网络（图4）。同样，若稀疏解卷积增强与商业SD-SIM结合，可以很容易实现活细胞上的三维、四色超分辨率成像。稀疏解卷积可以与膨胀显微镜（ExM）【8】结合，解析细胞膨胀后的复杂结构；也可以与宽场、点扫描的共聚焦、受激辐射损耗显微镜（STED）【9】以及微型化双光子显微镜（FHIRM-TPM 2.0）【10】结合，实现近两倍的空间分辨率提升。因此，稀疏解卷积的提出，将帮助使用各种各样荧光显微镜的生物医学研究者更好地分辨细胞中的精细动态结构。图4 | Sparse SD-SIM解析活细胞三维线粒体外膜网络。（k）活体COS-7细胞的线粒体外膜（Tom20-mCherry标记）的三维分布，颜色表征深度。（l）SD-SIM原始数据与Sparse SD-SIM的水平（左）和垂直（右）的白色框区域放大展示。比例尺：（k）5 μm；（l）1 μm。总之，通过稀疏解卷积算法（Sparse deconvolution）来实现计算荧光超分辨率成像，与目前基于特定物理原理或者特殊荧光探针的超分辨率方法都不相同。与超快结构光超分辨显微镜结合形成的Sparse-SIM是目前活细胞光学成像中，分辨率最高（60纳米）、速度最快（564帧/秒）、成像时间最长（1小时以上）的超分辨光学显微成像手段。它也可以与现有的多数商业荧光显微镜结合，有效提升它们的空间分辨率，看到更清楚的精细结构动态。