堆叠式恒温冷冻摇床

半导体设备巨头东京电子近日宣布，其位于东京电子宫城的开发团队（其等离子体蚀刻系统的开发和制造基地）开发了一种创新的蚀刻技术，能够在堆叠超过400层的先进3D NAND器件中生产存储沟道孔。该团队开发的新工艺首次将介电蚀刻应用于低温范围，生产出具有极高蚀刻率的系统。这项创新技术不仅可以在33分钟内实现高深宽比的10µm深蚀刻，而且与以前的技术相比，还可以将全球变暖的可能性降低84%。蚀刻结构的几何形状非常明确，如图1所示。这项技术带来的潜在创新将推动更大容量的3D NAND闪存的开发。图1.蚀刻后的存储器沟道孔图案的截面SEM图像和孔底部的FIB切割图像。图2 3D NAND闪存TEL开发这项技术的团队在6月11日至6月16日在京都举行的2023年超大规模集成电路技术与电路研讨会上提交其研究结果报告，该研讨会是最负盛名的半导体研究国际会议之一。

施一公和他的研究团队在实验室　　核心提示丨“这张幻灯片是最简单的，也是最难得的。” 在昨天上午的施一公研究组剪接体的三维结构RNA剪接的分子结构基础重大成果发布会上，清华大学生命科学学院院长、生命科学与医学研究院院长施一公打开一张照片，如是说。　　这个诞生了世界级顶尖成果的实验室，究竟有什么与众不同之处?剪接体的三维结构，是如何一步步清晰地呈现在世人面前?昨日，大河报记者实地探访施一公团队的实验室。　　探访丨废寝忘食做实验，每个人都是拼命三郎　　“你只要去实验室就会有人。”昨天中午12点，发布会刚结束，记者询问施一公团队的闫创业博士，实验室中午有没有人在时，他这样回答。　　施一公团队的实验室，位于清华大学医学科学楼三楼。记者进入实验室时，已经是12点15分。虽然正值午饭时间，但是实验室内，仍有不少人在埋头工作。　　实验室如同一个布满试管、药水瓶、白大褂的森林，让人看着眼晕。施一公说，这项成果最大的困难，是样品准备。“也就是说如何让蛋白质服服帖帖、性质稳定，成为适合结构解析的样品。”　　在实验室的摇床上，养着酵母。这些酵母承担着做成冷冻样品的重任。前期样品的制备主要由杭婧和万蕊雪承担。由于经验相对缺乏、没有师兄师姐可以请教，她们只能依靠阅读大量的文献和反复进行实验来不断探索前行。到了课题的攻坚阶段，每天在实验室工作14-16小时。即便在这样的工作状态下，也没有人敢松懈。“我们都很有危机感，因为我们知道这个课题的重要性，也知道很多团队都在做，而科学上只有第一没有第二，如果我们自己不沉下心来努力，一旦别人首先发表，我们之前的工作意义就会大打折扣。”万蕊雪说。　　冲刺丨最后两个月，施一公团队每天“玩命写论文”　　带领他们往前冲、努力拼的正是施一公教授。时间跳转到2个月前，这项研究的最后冲刺阶段。施一公带领3个学生每天“玩命写论文”。那段时间，他们每天写论文到凌晨，有时候甚至写到早上5点。“回到家6点多，躺下睡到8点又起来接着写。”施一公说，“身体极其疲乏，但精神亢奋，睡不着。”就连在送孩子回河南老家的火车上，4个小时的车程，施一公就埋头写了4个小时。某天凌晨3点，还在办公桌前写论文的施一公忽然尾椎抽筋，一动不能动，这样的突发状况吓坏了3个学生。休息了一会缓过来后，施一公起身在办公楼里快走了好几圈，终于才渐渐恢复。　　跟着施一公一起“玩命写论文”的3位学生，就是这2篇文章的共同第一作者——清华大学生命学院闫创业博士，医学院博士研究生杭婧、万蕊雪。3人中，年龄最大的闫创业今年30岁，而杭婧和万蕊雪则分别是26岁和25岁。　　“我的作用，主要是带这个团队讨论问题。我是打酱油的。”施一公开玩笑说。实际上，他的刻苦，带领这个团队一直向前冲。早在研究生阶段后期，施一公的刻苦在实验室是出了名的。在纽约做博士后时期，施一公每天晚上做实验到半夜3点左右，回到住处躺下来睡觉时常常已是4点以后 第二天9点左右又会准时回到实验室。当时他住在纽约市曼哈顿区65街与第一大道路口附近，离著名的中央公园很近，那里时有文化娱乐活动，但在纽约工作整整两年，施一公从未迈进中央公园一步。　　挑战丨竞争对手这么多，做不出成果怎么办?　　其实，早在10多年前，施一公就曾想开展剪接体结构的研究。“回国后，实验室刚建立起来，想找一些可以很快出成果的课题让学生们做，帮助他们树立科研信心。”施一公坦言，2009年，他的课题组开始正式进入剪接体研究的核心领域。　　国内外竞争对手这么多，如果这个课题做不出成果怎么办?杭婧曾有过担心和怀疑。“我们选择从小处着手，试图从解析剪接体复合物中的一些重要组成蛋白的结构开始，逐步接近目标。”杭婧说，2014年初，团队首次报道剪接体复合物中重要组成蛋白Lsm七聚体及其在RNA结合状态下的晶体结构，文章发表于《自然》，给了大家极大的信心。　　“我们的成功主要有三点。一是有三个学生，技术炉火纯青。二是很有胆识，找到正确的物种来做，并在计算方式上大胆改进。三是在合适时间做。现在清华有合适的冷冻电镜。”施一公总结，而我，在关键时候做一个判断。收完样品后，我说，只要有15埃的分辨率就很好了，如果做到15埃的分辨率，就发个文章，告诉大家我们也做了几年。结果算出来竟然有3.6埃。我们在今年整个4月份里做计算，那一个月突破连连、都跟做梦似的!　　机遇丨幸运之神，何以垂青施一公团队?　　3.6埃的分辨率是啥概念?施一公回答：几乎看到原子。他特别提出，如果没有清华大学冷冻电镜平台，是不可能完成这项成果的。　　冷冻电镜相当于一个照相机，当前面提到的冷冻样品被送到冷冻电镜时，会生成很多数据。这就相当于一个三维的东西，拿二维照相机拍很多张照片，重构出三维模型。而这个三维模型，就是剪接体的三维结构。　　在生命科学领域，研究蛋白质结构有三种主要方法：X射线晶体衍射、核磁共振以及单颗粒冷冻电子显微镜(冷冻电镜)。施一公说，早在冷冻电镜技术还远未成熟的2007年，清华大学就在上述三种方法中选择了重点发展冷冻电镜技术。　　“剪接体很多人想做。我1995年做博士后，一位曾经获得诺贝尔奖的科学家说，剪接体做不下去，太动态。它被称为大家都想做的‘终极课题’。”施一公说，大家都知道这些东西是核心的东西。但是剪接体不敢碰，因为手段不存在，就是没法做。很低分辨率，看得模模糊糊。“真正有胆儿做，还不行，还得时机成熟。2013年初，在世界科研科学领域，冷冻电镜技术取得突破。打个比方说，以前的照相机技术不行，照片非常模糊，有层霜。2013年，这层霜去掉了。这时候，我们的研究才突飞猛进。”　　施一公说，如果没有冷冻电镜技术，就完全不可能得到剪接体近原子水平的分辨率。“如果没有冷冻电镜肯定做不到今天的结果，而当年确实没想到冷冻电镜会出现飞跃性的进展。但是你不能等到万事俱备的时候才开始，那时候黄花菜都凉了。”

Science：施一公团队首次揭示人源IgM-B淋巴细胞受体组装的分子机制北京时间2022年8月19日，西湖大学施一公团队在《科学》（Science）上发表了题为《人源IgM B细胞受体的冷冻电镜结构》（Cryo-EM structure of the human IgM B cell receptor）的研究论文。该论文首次报道了人源IgM同种型B细胞受体（IgM-BCR）的高分辨率三维结构，揭示了膜结合的IgM（mIgM）与Igα和Igβ异源二聚体复合物组装的分子机制，从而回答了B细胞受体如何组装这一重要科学问题，同时也为基于B细胞受体的免疫疗法提供了关键的结构基础。B细胞也叫B淋巴细胞, 是适应性免疫系统的重要组成部分。它在抗原刺激下可分化为浆细胞和记忆B细胞：浆细胞可合成和分泌抗体，是人体的免疫屏障之一；记忆B细胞则可以“记录”下感染信息，并在体内长期存在，以备不时之需。B细胞需要抗原与B细胞受体（BCR）的结合，才能进行增殖和分化，产生浆细胞和记忆细胞。这就好比，如果B细胞要组织一场免疫战斗，入侵的抗原是敌人，B细胞受体（BCR）则是探知敌人虚实的先锋。B细胞的“生命周期”概略示意图早在1990年，德国马普所的Michael Reth实验室就鉴定发表了BCR的组分，在之后的三十多年中，人们对BCR胞外区如何识别各种抗原并激活B细胞信号通路进行了深入的研究。BCR由膜结合的免疫球蛋白（mIg）和Igα/Igβ异二聚体组成。其中mIg负责与抗原结合，Igα/Igβ参与信号传递。抗原结合以后，BCR在细胞膜表面寡聚化，Igα和Igβ被Lyn激酶磷酸化，之后激活下游信号通路。BCR被认为是治疗B细胞恶性肿瘤的重要治疗靶点。例如，Polatuzumab vedotin是一种抗体偶联药物，该药物可以结合BCR中的Igβ组分，释放偶联的毒素分子，对B淋巴瘤细胞进行精准杀伤。尽管BCR十分重要，但科学家一直未能看清其结构。一旦获知BCR的结构信息，对于理解B细胞活化以及针对该复合物进行抗体药物的开发，将具有很高的潜在价值。BCR根据mIg类型的不同，可以分为五种类型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。此次施一公团队的研究对象，正是其中的IgM型。实验过程中，他们首先将IgM-BCR的四个组分的cDNA进行密码子优化并克隆到表达载体上，接着通过共表达内质网潴留蛋白pERp1促进IgM二硫键的形成，帮助其正确折叠。之后，在蛋白纯化时加入抗体偶联药物Polatuzumab的Fab片段，最后通过冷冻电镜解析了第一个人源IgM同种型B细胞受体复合物3.3 埃(1埃等于0.1纳米)的高分辨率结构（图1）。图1 IgM-BCR复合物的整体结构图该IgM-BCR复合物结构包含一个mIgM和一个Igα/Igβ，它们以 1:1 的化学计量比非共价结合。在Igβ的上方，观察到了Polatuzumab的Fab片段的电子密度，证实了Polatuzumab结合在Igβ氨基末端的柔性区域。在IgM-BCR的胞外区域，重链的胞外域与 Igα/Igβ的胞外域紧密堆叠。在近膜区域，两条重链中的一条通过连接肽（linker）穿过由 Igα/Igβ包围的中空结构。在跨膜区域，mIgM和Igα/Igβ的跨膜螺旋（TM）形成一个四螺旋束，通过跨膜螺旋之间的氢键来稳定构象（图2）。图2 IgM-BCR复合物组装的细节图这样的结构特征暗示了mIgM和Igα/Igβ在细胞内通过共折叠的方式形成复合物。施一公团队通过体外pull-down和体内免疫共沉淀（co-IP）实验， 验证了IgM-BCR的组分通过共折叠的方式在细胞内形成复合物的猜想，同时揭示了TM和linker在复合物组装中的重要作用。除此之外，该结构揭示了胞外域上的 14 个糖基化位点，并发现三个潜在的表面抗体结合位点，可能有助于用于疾病干预的治疗性抗体或微型蛋白质的理性设计（图3）。和已经批准的抗体偶联药物Polatuzumab vedotin一样，这些特异性结合IgM-BCR的抗体或微型蛋白质，具有治疗B细胞淋巴瘤的潜力。图3 IgM-BCR糖基化位点分布图Science的审稿人对该项研究给予了高度评价：“这是B细胞生物学的一大突破，也是一项非常了不起的成就。”西湖大学生命科学学院施一公教授及其团队博士后宿强为本文的共同通讯作者。西湖大学生命科学学院博士后宿强、清华大学生命科学学院博士生陈梦莹以及西湖大学访问学生、郑州大学博士生史嫣为本文的共同第一作者。西湖大学生命科学学院助理研究员张晓峰、博士后黄高兴宇、博士生黄邦栋，郑州大学刘章锁教授、刘东伟教授，参与了本研究的部分工作。电镜数据采集于西湖大学冷冻电镜平台，计算工作得到西湖大学高性能计算平台的支持。本研究获得了科技部、国家自然科学基金委、西湖教育基金会、西湖大学、西湖实验室的相关经费支持。Science：哈工大黄志伟课题组发文揭示人B细胞受体复合物组装的分子机制8月18日，哈尔滨工业大学生命学院/生命科学中心黄志伟课题组在《科学》（Science）上发表题为《两种亚型的人类B细胞受体的冷冻电镜结构》（Cryo-EM structures of two human B cell receptor isotypes）的研究文章，揭示了BCR复合物亚基的组装、识别机制，以及发现不同亚型BCR尽管在膜内具有保守的组装模式，然而在胞外却具有不同的组装模式。人类适应性免疫细胞（T细胞和B细胞）在病原感染、癌症发生以及自体免疫疾病中起着关键作用。T、B细胞分别通过T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）识别抗原信号，把信号跨膜传递至胞内，激活T、B细胞的免疫反应。T、B细胞受体属于一类由多个蛋白组成的最复杂的细胞受体，对T、B细胞的发育、分化、功能起着至关重要的作用。TCR和BCR复合物信号转导，免疫激活的结构基础与分子机制问题一直是免疫学领域的重要基础科学问题。人IgG-和IgM-BCR复合物结构人类B细胞受体有5种亚型，在该研究中，该课题组解析了人IgG和IgM两种亚型的BCR复合物结构，BCR复合物结构包含了一个膜结合形式的免疫球蛋白（mIg）同源二聚体，用于识别抗原，以及一个膜结合形式的Igα/β（CD79α/CD79β）异二聚体，用于信号传递（化学计量比为1:1）。其中，mIg二聚体包含了Fab和Fc结构域、连接肽（CPs）和跨膜（TM）螺旋，Igα/β结构由两个胞外Ig样结构域、CPs和TM螺旋组成。IgG和IgM-BCR复合物的组装分别由胞外的IgG-Cγ3和IgM-Cμ4与Igα/β的Ig样结构域，以及连接肽、跨膜螺旋承担。课题组通过两个亚型的结构比较发现，mIgG和mIgM的跨膜螺旋区通过保守的疏水和极性作用与Igα/β 结合。相比之下，在胞外区域，IgG-Cγ3和IgM-Cμ4分别通过“首尾相连”（head-to-tail）以及“肩并肩”（side-by-side）的模式与Igα/β的Ig样结构域结合，其中，Igα的CD loop 旋转了90度，分别与Cγ3和Cμ4结构域结合。结构上观察的不同亚型组装模式是否和活性有关值得进一步研究。人IgG-和IgM-BCR复合物结构比较分泌型sIgM通常形成五聚体，但在膜结合的静息态BCR上只观察到IgM的单体状态。结构分析显示Igα的Ig样结构域和膜结合的IgM-Cμ4完全重合，从而解释了膜结合的静息态IgM-BCR为什么处于单体状态。BCR的激活通常伴随着BCR多聚体的形成，静息状态下，由于Igα/β的Ig样结构域与Cμ4或Cγ3结合，在空间上阻断了mIg寡聚化，而当抗原结合后可能会对Fab结构域施加机械力，以触发mIg_Fc的结构变化，从而释放被Igα/β占据的Cγ3或Cμ4的寡聚体界面，导致BCR分子形成寡聚体启动下游信号转导，其潜在机制还有待进一步研究。电子密度分析分别在IgG和IgM-BCR上清晰地鉴定出6个和14个糖基化位点。分泌型sIgM和膜结合型mIgM-BCR复合物结构比较上述数据不仅解析了长久以来关于BCR结构与组装机制之谜，且对认识BCR启动免疫反应的分子机制，以及开发靶向BCR的免疫疗法用于治疗相关疾病提供了关键结构基础。同期《科学》（Science）“观点（Perspective）”栏目发表了评论文章《揭开B细胞受体结构面纱——分子结构为理解和控制B细胞受体活性提供了路径》（Unveiling the B cell receptor structure - Molecular structures provide a road map for understanding and controlling B cell receptor activation），对该研究成果进行了介绍。近年来，在人免疫细胞受体的结构与分子机制研究方面，黄志伟课题组首先通过解决TCR、BCR复合物的动态复杂性等技术问题，解析人TCR复合物的三维结构，揭示TCR复合物的亚基组装、识别机制（Nature, 2019）。课题组通过进一步解析高分辨率的TCR复合物结构，发现TCR跨膜区域存在“胆固醇结合通道”（Molecular Cell, 2022），胆固醇分子结合于该通道抑制TCR激活，通过去除胆固醇分子引起TCR组成型激活，揭示了TCR激活的结构基础，从而提出TCR的“胆固醇——门栓”控制理论，为理性设计靶向TCR调控T细胞活性的免疫疗法提供理论依据。哈尔滨工业大学生命学院/生命科学中心黄志伟教授为本论文的通讯作者。生命学院2021级博士研究生马新宇、朱玉威副研究员、董德博士、陈彦博士为该论文的并列第一作者。生命学院2021级博士研究生王书博、张帆研究员、郭长友博士等参与该研究的部分工作。本项目受到国家自然科学基金委、腾讯科学基金、哈工大青年科学家工作室等基金的资助。