感温包灵敏度测试台

Argonaute 蛋白的特点是高效的指导 DNA/RNA 定向结合目标核酸。 2022年2月22日，河北科技大学韩春雨团队在预印版bioRxiv 在线发表未经同行评审的题为“Introducing an argonaute-facilitated PCR platform”的研究论文，该研究设计了一个 argonaute 促进的 PCR 平台，利用源自 Mesorhizobium japonicum的 argonaute (MejAgo) ，该平台不携带核酸酶活性并在结合时暴露引导 DNA 的 3' 端。 MejAgo-PCR 平台的每个反应循环都由变性步骤和聚合酶介导的延伸步骤组成，省略了传统 PCR 所需的退火步骤。更重要的是，MejAgo-PCR 可以显著提高 PCR 在模板检测中的灵敏度，这是由于向导 DNA/引物和模板之间的 argonaute 促进配对。因此，argonaute 促进的 PCR 具有发展为具有更高灵敏度和效率的PCR 平台的潜力。另外，2022年1月21日，河北科技大学韩春雨团队在Nucleic Acids Research（IF=17）在线发表题为“A Cas6-based RNA tracking platform functioning in a fluorescence-activation mode ”的研究论文，该研究利用这一特性设计了一个基于 Cas6 的开关平台，用于在体内检测目标 RNA。将split-Venus片段与内切核糖核酸酶突变的大肠杆菌 Cas6 (dEcCas6) 的两端结合，允许配体 (CBS) 激活分split-Venus互补。该研究将此平台命名为基于 Cas6 的荧光互补 (Cas6FC)。在活细胞中，Cas6FC 可以检测几乎没有背景噪声的目标 RNA。此外，只要在感兴趣的 RNA 中标记一个 CBS (29nt) 副本，就能够打开 Cas6FC 荧光，这大大降低了目标 RNA 构象和定位的潜在改变的可能性。因此，该研究开发了一种新的 RNA 跟踪平台，其固有地具有高灵敏度和特异性聚合酶链式反应（PCR）的发明极大推进了现代生物学研究。此外，鉴于测试追踪和隔离策略 (TETRIS/TTI) 是迄今为止控制传染病的最有效方法，PCR 已广泛用于医疗保健服务。一个明显的例子是在当前 COVID-19 大流行中使用 PCR 检测受感染但无症状的个体。尽管出现了许多核酸检测新技术，但世界卫生组织建议，基于定量 PCR (qPCR)的检测平台仍被认为是 COVID-19 检测的黄金标准。核酸扩增是包括传统PCR在内的所有已开发的核酸检测系统的基础。也不例外，最近开发的SHERLOCK系统利用了重组酶-聚合酶扩增 (RPA)。因此，某个检测系统的灵敏度取决于其依赖扩增策略的灵敏度。从这个意义上说，虽然 SHERLOCK 系统具有混杂 RNAse 活性的“附带效应”，但最初的 RPA 促进的扩增决定了随后的 Cas13a 介导的二级信号放大的可靠性。因此，如果目标模板的滴度低于 RPA 灵敏度的阈值，则 SHERLOCK 声称的优势是不存在的。传统的 PCR 是一种异热反应，使用重复的加热和冷却循环来复制特定区域的 DNA。相比之下，等温扩增发生在稳定的温度下，这显然具有无需设备、省时和便携的许多优点。RPA 促进的 PCR 是一种等温反应，其中 UvsX 重组酶携带引物并促进其与双链 DNA (dsDNA) 模板的配对。RPA 采用重组酶-引物复合物扫描双链 DNA 并促进同源位点的链交换，省去了传统 PCR 所需的高温变性过程，从而可以进行等温扩增。然而，RPA 平台还需要单链 DNA 结合蛋白，该蛋白相互作用并防止移位的模板链通过分支迁移弹出引物。此外，重组酶反应需要 ATP 的存在用于能量输入。此外，重组是一个复杂的过程，其机制尚未完全解决。因此，对于用于 RPA 平台的引物的优化，尚未建立明确的规则。因此，在应用RPA时，不可避免地需要额外的引物筛选过程，这显然是费力的。无论扩增过程是异温还是等温，引物与模板的结合是扩增的第一步，结合的效果决定了后续扩增的灵敏度。传统PCR的引物-模板配对过程完全依赖于引物和模板之间的随机物理相互作用。在这种依赖热力学定律的系统中，增加引物浓度肯定会提高与模板配对的效率。然而，由于引物之间以及引物和模板之间的非特异性错配，必须考虑对准确性的权衡影响。Argonaute 蛋白可以高效地引导 DNA/RNA 定向结合到靶核酸。对argonaute促进靶向机制的研究表明，argonaute蛋白可以加速引导与靶核酸的结合。在这项研究中，证明了源自Mesorhizobium japonicum的 argonaute (MejAgo) 可用于增强引物-模板配对。借助此功能，MejAgo 促进的 PCR 系统可以提高核酸检测的灵敏度。参考消息：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.02.22.481407v1

明尼苏达州，明尼阿波利斯，2013年6月10日&mdash 全球科学服务领域的领导者，赛默飞世尔科技（以下简称：赛默飞）今天推出新一代三重四极杆液相色谱质谱（LC-MS）平台，该平台专为定量实验设计，具有极佳的灵敏度，更高的运行通量，更优精度和易用性。 平台包括新型Thermo Scientific Quantiva 三重四极杆质谱仪和新型Thermo Scientific Endura 三重四极杆质谱仪，于6月9日至13日在明尼阿波里斯会议中心召开的美国质谱年会（ASMS）上首度亮相。 &ldquo 应用领域的不断发展持续推动了对仪器极限性能的提升&rdquo ，赛默飞色谱质谱研发副总裁Iain Mylchreest如是说，&ldquo 我们已创建了完整的新仪器平台，能够为客户提供最佳灵敏度和运行时间。同样重要的还有令人满意的用户体验、简便实现方法创建和便捷的数据分析和回顾。我们相信该仪器是目前市场中最高效、最实用的三重四极杆。&rdquo TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪利用主动离子管控技术（Active Ion Management，AIM）优化离子生成及从离子源至检测器的传输，由此获得极限灵敏度。与先前的赛默飞三重四极杆相比，灵敏度水平的显著改善了诸如肽段定量、代谢物组学和生物制药QA/QC等应用领域的结果。在公司实验室中，AIM增强系统以优异精度成功检测血浆中70阿克的维拉帕米，这是先前从未达到的出色性能水平。 TSQ Quantiva MS系统也具有极高的通量，每秒可运行500个SRM实验；在20毫秒内即可实现正/负极性切换，无任何信号损失。全新的离子束传输组件（Ion Beam Guide）和中性离子挡杆（Neutral Blocker）可使系统组件免受污染，令常规维护变得更加简便。使用人工血清样品进行压力测试，与赛默飞先前的最佳系统相比，TSQ Quantiva MS维护间隔时间大约延长三倍，且无任何信号损失。 TSQ Endura三重四极杆质谱仪拥有TSQ Quantiva MS的多项先进技术，与同类其他竞争仪器相比具有更长运行时间。其设计用于痕量水平定量，如食品检验、环境分析和制药QA/QC等应用领域。 共用离子源和软件 TSQ Quantiva MS系统采用与赛默飞新型Orbitrap Fusion Tribrid LC-MS系统（同期也在ASMS上推出）相同的离子源室，两者均采用相互即插即用设计。在安装离子源时，气体和电气连接可自动建立，系统还将自动识别ESI、APCI和纳喷雾室及探针。 全新三重四极杆与全新Orbitrap Fusion Tribrid系统使用软件相同，这可以大大简化对两套系统的学习和使用。系统间的方法参数可自动转移，方便利用两种仪器进行的探索和验证研究。 Mylchreest补充说：&ldquo 提高易用性是该项目的核心目标。我们知道许多用户会同时使用我们的组合质谱和三重四极杆技术。我们就此创建了一整套平台，使客户能够在同一实验室中更方便地使用这两种系统，享受集成化便利。&rdquo 若要查看整个赛默飞产品系列，包括全新质谱仪、软件和耗材等，可访问Thermo Scientific 154 号展台或在线登录www.thermoscientific.com/asms 或 www.thermofisher.com/news。 关于赛默飞世尔科技 赛默飞世尔科技（纽约证交所代码： TMO）是科学服务领域的世界领导者。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额130亿美元，员工约39,000人。主要客户类型包括：医药和生物技术公司、医院和临床诊断实验室、大学、科研院所和政府机构，以及环境与过程控制行业。借助于Thermo Scientific、Fisher Scientific和Unity&trade Lab Services三个首要品牌，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。我们的产品和服务帮助客户解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com 关于赛默飞中国 赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数超过2300名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有5家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在北京和上海共设立了5个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国技术中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的维修服务中心，在全国有超过400名经过培训认证的、具有专业资格的工程师提供售后服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录www.thermofisher.cn

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，High-Sensitivity Proteome-Scale Searches for Crosslinked Peptides Using CRIMP 2.0，该文章的通讯作者是卡尔加里大学的David C. Schriemer教授。　　交联质谱(XL-MS)是一种在蛋白质空间中生成点对点的距离测量值的有价值的技术。然而，基于细胞的XL-MS实验需要高效的软件来灵敏及错误率可控地检测交联肽。已经有许多算法通过过滤策略，在进行交联搜索之前达到缩减数据库的大小的效果，但也有人担心使用这些策略可能会降低灵敏度。　　本文提出了一种新的评分方法，使用快速预搜索方法和受计算机视觉算法启发的概念来解析来自其他冲突反应产物的交联。对几个精选的交联数据集的搜索显示了很高的交联检测率，即使是最复杂的蛋白质组水平的搜索(使用不可断裂或可断裂的交联剂)也可以在传统的台式计算机上高效地完成。通过在评分方程中包含组成项，蛋白质−蛋白相互作用的检测增加了两倍。该组合功能可在软件Mass Spec Studio中作为CRIMP 2.0提供。　　CRIMP 2.0 集成了改进的库缩减引擎和新的评分算法，可解决所有类别命中(例如游离肽、单链和交联)的谱图冲突。文章中修订后的误差估计方法考虑了在其他搜索工具中大多被忽略的跨类别的谱图冲突，并支持检测蛋白质-蛋白质相互作用的新方法。本文证明了库缩减策略确实可以提供高灵敏度，并支持不可断裂和可断裂实验类型的全蛋白质组分析，并且只需使用很少的计算资源。　　图1 概述了搜索MS2数据集以寻找肽交联证据的典型方法的示意图。单通道方法从假定的交联肽的前体质量开始，并通过一个涉及α肽质量、β肽质量和交联剂质量的简单的三项加和来限制数据库搜索。然后，在MS2谱图中搜索组合。双通道方法由MS2谱图开始并结束：首先，在MS2数据中发现了候选α和β肽，此时，前体质量才用于限制组合，以便对MS2数据进行更详尽的搜索。　　图2 使用Beveridge等人研究的DSS交联剂的复制数据集测试交联灵敏度。以(A)为5%和(B)为1%的计算FDR值对Cas9数据库进行了分析。分段Cas9数据库的结果在(C)为5%和(D)为1% FDR，显示为蛋白内和蛋白间搜索结果。使用多个添加的数据库显示诱饵数据库的效果，并注意到蛋白质的复杂性。真实的%FDR展示为标注数字。　　图3 使用 DSSO 作为交联试剂和阶梯式HCD MS2 方法进行数据采集的平均交联肽段数目。上述算法的所有结果均来自添加了 CRIMP 2.0 的 Matzinger 等人，预期 FDR 为 1%(成对的左条)，并使用分数后截止显示校正结果以达到实验验证的 FDR 1%(成对的右条)。　　图4 合成肽基准数据集2中检测到的 PPI 数量，来自Matzinger 等人的研究。　　蓝色条表示以估计的 5% FDR 进行的搜索，橙色条表示以估计的 1% FDR 进行的搜索。检索基准中的所有三组数据，并在搜索数据库中使用指示数量的蛋白质来探索诱饵的影响。真实的%FDR展示为标注数字。　　图4 使用两种交联试剂交联大肠杆菌蛋白质组的 PPI 搜索结果。大肠杆菌蛋白质组使用两种交联试剂。(A)以目标5%FDR进行的搜索和(B)以目标1%FDR进行的搜索。结果基于Lenz等人研究中建立的近似PPI数据库，使用成分知情PPI评分方法。图底部的百分比显示了基于库组成的计算出的 FDR 值。　　本文的结果表明，双通道数据库简化方法可以返回复杂样品中交联组成的灵敏测量。控制数据库限制的程度允许用户调整搜索速度以满足实验的需要，而不会引起对极大的灵敏度损失，因为对搜索参数的依赖性是适度且可预测的。通过对关键搜索词(如N，Eα和Eβ)进行细微的调整，即使是人类蛋白质组和密集的数小时LC - MS / MS运行也可以在一天或更短的时间内在一台台式计算机上进行处理，例如本研究中使用的那样。对于高度复杂的系统，蛮力穷举方法可能被证明不如双通道方法敏感。数据库的不必要扩展可能会产生嘈杂的搜索，就像蛋白质组学搜索使用过多的变量修改进行参数化时所做的那样。CRIMP允许对可裂解和不可裂解的交联剂进行强健的搜索，而不可裂解试剂在原位应用中应得到更多关注。这些试剂更容易合成，并且在这种规模上显然是互补的。此外，这些试剂产生跨肽片段离子，这可能是验证命中值的必要条件，特别是在探索相互作用由翻译后修饰定义的高度复杂状态时。总而言之，本文提出的 CRIMP 2.0 提供了此类活动所需的灵敏度和搜索速度。　　撰稿: 聂旻涵编辑: 李惠琳　　原文: High-Sensitivity Proteome-Scale Searches for Crosslinked Peptides Using CRIMP 2.0　　参考文献　　1. Crowder DA, Sarpe V, Amaral BC, Brodie NI, Michael ARM, Schriemer DC. High-Sensitivity Proteome-Scale Searches for Crosslinked Peptides Using CRIMP 2.0. Anal Chem. 2023 95(15):6425-6432. doi:10.1021/acs.analchem.3c00329