紫外测定单组分三种方法

测定蛋白质浓度的方法有很多，科研工作者广泛使用的方法比如紫外吸收法，双缩脲法，BCA方法，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法等等 ，今天小编以UV法，BCA法，考马斯亮蓝法，其中的三种方法的测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项做详细介绍。UV法这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受 到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。（1）简易经验公式 蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor（2）精确计算 通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D，其中d为测定OD值比色杯的厚度，D为溶液的稀释倍数BCA法原理：BCA（bicinchonininc acid）与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu2+ 还原为 Cu+，工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562 nm 下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。BCA 蛋白浓度测定试剂盒，Abbkine的蛋白质定量试剂盒（BCA法）提供一个简单，快捷，兼容去污剂的方法，准确定量总蛋白。成分试剂 A100 mL试剂 B2 mL标准蛋白（BSA）1 mL×2，1 mg/mL保存条件 运输温度：室温（标准蛋白 4～8 ℃ 运输）保存温度：室温（标准蛋白 -20 ℃ 保存）有效日期：12 个月使用方法方法一：96 孔板1. 配制 BCA 工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液。充分混匀。2. 将蛋白标准品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白标准品孔中。加灭菌双蒸水补足到 10 μL。取 10 μL 待测样品加入 96 孔板的待测样品孔中。每个测定要做 2～3 个平行。3. 向待测样品孔和蛋白标准品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即样品与工作液的体积比为 1:20），混匀。4. 37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。5. 酶标仪 562 nm 波长下测定吸光度。6. 制作标准曲线。从标准曲线中求出样品浓度。方法二：试管法1. 配制工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液，充分混匀。工作液配制的量要与测定所用的比色杯对应。每个测定要做 2～3 个平行。本处列举的比色体系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯规格不同，体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。2. BSA 标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲液配制，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备 3 个平行测定。标准曲线一般 5~6 个点即可。根据样品的估测浓度确定各点的具体浓度。稀释 BSA 时可以用水或与样品一致的溶液。如待测样品的浓度约为 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 标准品、样品及 BCA 工作液。3. 取适量体积的标准蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混匀。37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。4. 将样品与标准品在 562 nm 波长下测定吸光度。考马斯亮蓝法实验原理：考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。目前，这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。考马斯亮蓝 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 (特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基相结合。突出优点（1）灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最di蛋白质检测量可达 1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和需要严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。缺点（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 (SDS) 等。试剂与器材1、试剂 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸馏水稀释至 1000 mL。2、标准和待测蛋白质溶液（1）标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。（2）待测蛋白质溶液。 人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀释 200 倍。3、器材 试管 1.5×15 cm（×6），试管架，移液管管 0.5 mL（×2） 1 mL（×2） 5 mL（×1）；恒温水浴；分光光度计。操作方法 一、制作标准曲线 取 7 支试管，按下表平行操作。摇匀，1 h 内以 0 号管为空白对照，在 595 nm 处比色。绘制标准曲线：以 A595 nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。二、未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的 A595 nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。注意事项（1）在试剂加入后的 5-20 min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最we定的。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。（3）利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。

研发和生产新冠疫苗和治疗药物的竞争使细菌内毒素检测（Bacterial Endotoxins Testing，BET）成为人们关注的焦点，并且其测定方法对于研究和生产至关重要。内毒素检测长期以来一直是单调乏味、耗时且容易出错，直到最近才有所创新。制药行业迫切需要一种能提高整体产量的内毒素检测方法，同时要完全合规、易于设置和培训分析员，并能减少出错几率。现在，随着疫情和快速找到疫情解决方案的需求，提高产量就变得尤为重要。软件是内毒素检测的另一个组成部分，现在它变得越来越重要，并有助于提高整体内毒素检测程序的效率。分析员和管理人员所使用的软件安装起来很麻烦，并且可能导致数据可靠性令人质疑。在当今的环境中，软件应该成为永远不会成为问题的分析组成部分。在每个步骤中数据都应是安全的，包括快速简便的签名过程。将软件需求与易用性、减少错误和增加产量需求结合在一起，为简化内毒素检测提供了充足的机会。现在，比以往任何时候都更重要的是，利用创新技术和优化程序来提高运营效率，同时保持合规性和准确性以支持制药行业需求。以下是简化内毒素检测的三种方法：1通过微流体实现自动化当今内毒素检测中最常见的问题之一是设置完整的96孔板所需的时间。不仅进行一次化验需要移液时间，而且在开始检测前，还需要投入大量时间对分析员进行全面培训和再培训。在传统的分析中，需要200多个移液步骤，一个失误可能导致对不合格检测进行重大且代价高昂的调查和重新检测。简单地将阳性产品对照（PPC）添加到微孔板上可能需要44个移液步骤！通过使用微流控技术、预嵌入的内毒素标准品和预嵌入的PPC，实现内毒素检测自动化。微流控技术不需要分析员的200多个移液步骤，而能直接使试剂和样品准确、快速的分散，从而实现过程的自动化并大大减少人工步骤。使用Sievers Eclipse月食细菌内毒素检测平台，总移液步骤少于30个，大大缩短了检测设置时间，减少了出错机会。2易用性和明确的根本原因分析96孔板检测需要熟练且训练有素的分析员才能正确执行。即使经过数月培训和拥有多年经验，错误发生也在所难免。无论是PPC孔错位、样品不正确还是稀释不当，所有这些都会导致重新检测以及存在对不合格检测进行代价高昂的调查。想象一下，使用Eclipse可以在同一天完成对分析员的培训和认证！而且可以最小化重新检测的时间，并使用明确的根本原因分析来结束调查。那肯定会使工作变得更简单。使用Sievers Eclipse精密的液体处理设备可大大减少移液步骤，并且具有自动控制功能，可帮助减轻技术中的任何错误。这使得培训分析员非常容易。只需不到30个移液步骤和一个封闭的系统，就可以在一天内使用Sievers Eclipse对分析员进行培训和认证，从而节省时间并提供更多交叉培训功能。除了简单的培训之外，还可以轻松地进行故障排除。Eclipse平台使用具有独特微流体技术的双镜筒光学器件，可以通过确定是否有适当量的液体没有进入最终的光学孔来进行读取，从而提供明确的根本原因分析。然后可以进一步研究以确定在设置过程中是否遗漏了微孔或微流体通道是否无法输送液体。将简单的培训和故障排除结合在一起，可简化内毒素检测过程，让您高枕无忧。3安全且简化的数据审查内毒素检测最后一个可简化的方面是数据审查和签字。这一过程的效率可能不太高，通常会迫使那些查看结果并签字的人员停止其正在执行的操作，移动到检测结果的位置进行签字。现今使用的一些方案甚至要求必须在每一个被分析的样品上签字，从而导致此过程非常耗时。当需要查找与检测相关的内容时，对审查记录进行审核也可能是一项艰巨的任务。Sievers Eclipse月食细菌内毒素检测平台有助于减轻传统测定带来的压力。拥有经过全面验证和兼容的软件，可使用户轻松地知道所有事情都已得到正确的跟踪和记录。另一个有用的功能是客户端和服务器软件设置。这允许具有适当权限的指定用户使用客户端从任意位置登录以检查结果。通过这种设置，负责审查和批准结果的人员可以从办公楼中的其他位置甚至在家中登录，并通过电子方式对多达21个样品的检测结果进行签字。每个电子签名都可以通过计算机和用户登录进行完全跟踪，从而提供完整而安全的审计追踪。除了这些功能之外，每个检测结果还有专用的审计追踪附在检测结果的末尾，这使所需的审计追踪审查和签字过程变得简单而高效。确保数据可靠性和简化审查流程使制药商能最大限度地延长运行时间并提高生产量。通过使用微流体技术来简化培训和设置过程，使用集成技术来帮助进行故障分析以及安全、简化的数据审查，内毒素检测现在可以变得轻松、快速。通过简化内毒素检测，制药商可以确保产品安全、同时提高样品检测率并减轻分析员的负担。*原文英文版刊登于《American Pharmaceutical Review》2020年11/12月刊，作者：Sydney Jannetta，本文有所修改。◆ ◆ ◆联系我们，了解更多！

近日，大连化学物理研究所复杂分子体系反应动力学研究组(1101组)杨斌副研究员与山东大学刘锋研究员等合作，开发出了具有高效白光发射的新型双钙钛矿材料，并制备了基于该材料的单组分暖白光发光二极管(LED)。电气照明占全球电力消耗的15%，释放了全球5%的温室气体。采用更加高效、低成本的照明技术可缓解能源、环境危机，助力实现“双碳”目标。目前，绝大多数白光LED技术主要依靠蓝光LED激发多组分荧光叠加的方式产生白光，因此很容易出现显色性差、发光效率低、有害蓝光成分高、白光光谱不连续等问题。开发高效单组分白光材料被认为是解决以上问题的关键。研究人员发现，非铅金属卤化物双钙钛矿材料可在低温溶液法制备，生产成本低。此外，由于自身结构的限域以及强烈的电—声子耦合效应，双钙钛矿材料具有独特的自陷激子特性(STE)，其复合发光表现出较大的斯托克斯位移及宽带光发射，从而表现出白光发射的特点。在本工作中，科研人员通过利用有机分子4, 4-二氟哌啶(DFPD)和碱金属之间的强化学键，制备了具有一维结构的(DFPD)2MIInX6 (MI= K, Rb X= Cl, Br)双钙钛矿化合物。其中，DFPD+不仅作为有效的层间间隔物来平衡电荷，而且可作为构成金属卤化物八面体的关键组分。特别地，(DFPD)2MIInX6中的电子态在空间上被限制在单个八面体中，产生了天然的电子限域效应。为了促进辐射复合，研究人员进一步采用微量Sb3+掺杂策略，将白光量子效率从5%提高到90%以上。由于所制备的低维双钙钛矿材料具有高光电性能和优异的溶液可加工性，可以通过简单的溶液法制备基于该材料的单组分暖白光LED，因此，该工作为下一代照明器件的设计提供新的思路。杨斌等近年来在基于自陷激子的单组分白光材料及其发光动力学领域开展了系统的研究：揭示了激子超快自陷过程(Angew. Chem. Int. Ed.，2019；Acc. Chem. Res.，2019)，以及电—声子耦合对该超快过程的影响机制(Sci. Bull.，2020)；揭示了基于自陷激子热活化延迟荧光的发光机制(Angew. Chem. Int. Ed.，2020)；通过三线态自陷激子与受体离子Mn2+之间的高效能量转移，实现了胶体纳米晶中的高效白光发射(Nano Lett.，2021)；并基于自陷激子独特的性质拓展了其在长余辉发光材料(Angew. Chem. Int. Ed.，2022)、高灵敏紫外光电探测器(Adv. Mater.，2021；Laser Photonics Rev.，2022)、X-射线闪烁体(J. Phys. Chem. Lett.，2022；J. Phys. Chem. Lett.，2022；Laser Photonics Rev.，2022)、超灵敏的光学测温器(J. Phys. Chem. Lett.，2022)等领域的应用。相关研究成果以“Highly Luminescent One-Dimensional Organic–Inorganic Hybrid Double-Perovskite-Inspired Materials for Single-Component Warm White-Light-Emitting Diodes”为题，发表在《德国应用化学》(Angewandte Chemie International Edition)上。该工作的第一作者是我所1101组联合培养博士研究生柏天新。上述工作得到国家自然科学基金、中科院青促会、我所创新基金等项目的支持。