液相质谱流动相中加甲酸量

离子对试剂：极性药物分析绕不开的话题 液相色谱是药物杂质含量测定和有关物质分离分析最常用的技术手段。对一个陌生的化合物，ODS反相色谱柱通常方法开发条件会选择酸性pH流动相。然而，总有些化合物，它们或含氨基、或含羧基、磺酸基团、磷酸基团，极性较强在反相色谱柱上没有保留。打开2020版《中国药典》第二部，不难发现这些品种，名称中常含有“马拉酸”、“盐酸”、“碱”、“酸”等关键词。对于这类强极性化合物的分析，药典给出的答案是：流动相中添加离子对试剂。例如丁溴东莨菪碱、贝敏伪麻的有关物质流动相条件中含有十二烷基硫酸钠；马来酸曲美布汀的流动相含有戊烷磺酸钠；盐酸头孢吡肟的流动相含有辛烷磺酸钠；叶酸、头孢美唑和对氨基水杨酸钠的流动相含有四丁基氢氧化铵。离子对试剂的添加，增强了极性化合物的保留，改善了药物与杂质的分离，是极性药物分析的杀手锏。 离子对试剂：“质谱不能承受之重” 辛烷磺酸钠和四丁基硫酸氢铵等常用离子对试剂，属于不挥发盐类，质谱响应强且信号经久不衰，持续抑制目标化合物的电离。一旦误操作进入质谱端，需要清洗整个离子通路才能恢复质谱的正常状态。常规二维液相在线除盐系统仅能去除无机盐，无法去除离子对试剂。这是因为无机盐（如磷酸盐）在二维反相色谱柱上无保留，在死时间将其切至废液从而实现在线除盐。然而离子对试剂具有较强的疏水性，在常规ODS色谱柱上强烈吸附显著拖尾，因此不能被常规二维液相系统去除。 上图是辛烷磺酸钠在ESI离子源上的响应。可生成簇离子，质谱响应强且持久，对ESI正负模式均可产生抑制。 上图是四丁基硫酸氢铵在ESI离子源正模式的响应，质谱响应强且持久。四丁基硫酸氢铵与固定相强烈作用，色谱上呈现显著拖尾。 ReDual:一款可以同时分离无机、有机、阴、阳离子的“神柱” ReDual系列色谱柱，是岛津公司最新推出的离子交换反相混合键合相色谱柱，共分为三款： ReDual™ SCX-C18 强阳离子交换+反相ReDual™ CX-C18 弱阳离子交换+反相ReDual™ AX-C18 强阴离子交换+反相 下图是采用ReDual AX-C18 (4.6 mm I. D. × 150 mm L., 5 µm，货号426-45415)分析磷酸二氢钠、四丁基硫酸氢铵和卡络磺钠混合样品的色谱图。该款色谱柱表面键合叔胺基团，在pH 2-7范围内色谱柱表面带阳离子。除疏水作用外，其对阴离子具有离子交换作用，对阳离子具有离子排斥作用。为分离极性类似的阳离子和阴离子型化合物提供了条件。下图中四丁基氨根离子峰型对称，不拖尾无残留，可以通过阀切换导入废液实现在线去除。 ReDual AX-C18色谱柱NQAD检测器同时分离无机有机阴阳离子（1：Na+ 2：四丁基氨根离子；3：H2PO3- 4：卡络磺酸根离子） 应用案例：卡络磺钠参比制剂中杂质结构鉴定 本应用采用常规中心切割二维液相系统，无需改造仪器；馏分转移过程配有紫外检测器监控，不存在检测盲区；离子对试剂的去除未使用强酸或强碱性试剂；方法耐用性好。一维使用C18反相色谱柱，流动相添加磷酸二氢钠（含四丁基硫酸氢铵，pH 3.0）；二维使用ReDual AX-C18色谱柱，在线去除四丁基硫酸氢铵和磷酸二氢钠，实现目标化合物的质谱鉴定。 卡络磺钠杂质2的质谱鉴定结果 总结岛津中国创新中心搭载的特色中心切割二维色谱杂质鉴定系统，二维使用岛津公司最新推出的ReDual™ AX-C18强阴离子交换反相混合键合相色谱柱，成功实现一维流动相中离子对试剂和无机盐的在线去除，并对卡络磺钠参比制剂中未知杂质进行了质谱鉴定。

药物中的杂质是指除药物化学体以外的任何成分，是反映药品质量和安全性的重要指标。在制药工业中，关于药物杂质的研究主要是聚焦在使用液相色谱对其进行分离、鉴别和定量上。ICH规定当药物中的杂质含量大于0.1%时，应进行定性。传统的方法是先将杂质进行分离制备，得到纯品后再通过NMR、IR及MS等仪器进行结构鉴别。此方法，一是周期长；二是分离制备成本高；三是一些含量较少且不稳定的杂质难于制备。而近年发展迅速的LC-MS联用技术，根据杂质的来源，产生条件，推测药物中可能含有的杂质，并结合药物母核的质谱裂解规律和杂质的产生原理推断杂质的结构，可以很好地解决这些缺点，已成为杂质研究的一种新理念，且该技术已被广泛应用于药物发现、开发、制造以及质量控制等各个阶段。 LC-MS联用技术中，液相色谱分离是进行质谱结构鉴别的基础，然而现有的很多液相色谱分离方法为改善分离或检测经常会使用非挥发性缓冲盐流动相(如磷酸盐缓冲溶液或离子对试剂)，这显然与质谱的ESI(APCI)-MS不兼容。因此当采用LC-MS联用技术时，必须将流动相转换为适合于ESI(APCI)-MS的挥发性流动相。而摸索新的适合于LC-MS联用技术的流动相体系往往很难对杂质进行有效分离，且又耗时费力。赛默飞UltiMate 3000双三元液相色谱（DGLC）可实现在线去除流动相中的非挥发性缓冲盐，让您无需改变现有的分析方法就可轻松使用LC-MS联用技术对药物杂质进行更深入的研究。 仪器系统连接双三元梯度泵的右泵保持原来的分析流动相条件不变，各杂质成分在一维分析柱中实现分离，通过2位置六通阀将已被常规检测器检测的目标杂质峰储存至loop环中；左泵采用与MS兼容的挥发性流动相，将储存在loop环中的目标分析物洗脱至二维除盐柱中，利用质谱上固有的六通阀，将流动相中的非挥发性盐除去，再调整左泵流动相比例将目标待测物洗脱至MS中，通过子离子扫描等方式，得到杂质的裂解碎片，结合物质的裂解规律，对药物中的杂质进行逐一鉴别。系统流路连接见图1.。图1 系统流路连接示意图 最适合质谱前端使用的在线脱盐技术应用阿莫西林（Amoxicillin），是一种最常用的青霉素类广谱&beta -内酰胺类抗生素，在2010版《药典》二部中，有关物质分析采用HPLC-UV法，流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（用2mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.0） 和乙腈，梯度洗脱。样品溶液在经过碱破坏后，其分离谱图见图2.。采用双三元液相色谱的在线脱盐技术，在一维色谱保持原有分析条件并经过UV检测后，可将其中的未知杂质成分（包括降解产物）切换并储存至loop环中；二维色谱分离系统采用与MS兼容的流动相，将储存在loop环中的目标分析物洗脱至二维除盐柱中，在线去除一维流动相中的磷酸二氢钾等非挥发性缓冲盐后，利用MS进行多级碎片离子扫描，结合&beta -内酰胺类抗生素的裂解规律，推断未知杂质成分的结构。整个过程在密闭系统内自动并连续地完成，而且可对其中的多个杂质同时进行结构鉴别。图2 阿莫西林碱破坏后的样品分离谱图（UV 230nm）图3 4号杂质TIC谱图（上图为负离子模式，下图为正离子模式）图4 4号杂质特征离子谱图（左图为负离子模式[M-H]-=338.1，右图为正离子模式[M+H]+=340.1,初步推断杂质分子量=339.1） 头孢地尼(cefdinir) 也属&beta -内酰胺类抗生素，用于对头孢地尼敏感的葡萄球菌属、链球菌属等菌株所引起的感染。原标准分析方法中使用了0.25%四甲基氢氧化铵溶液(用磷酸调节pH=5.5)+0.1mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液的非挥发性流动相，样品经过热破坏后分离谱图见图5. 在不改变原流动相条件的情况下，采用DGLC的流动相在线除盐技术，使用LC-MS联用技术对原料药中的杂质（包括降解杂质）成功进行了定性研究。且该方法可以将杂质逐一进行分析，结合已知文献，共鉴别了其中的6种杂质。 图5 样品经过热破坏后一维分离谱图（UV254 nm）图6 其中15号杂质的特征离子谱图(左图为负离子模式[M-H]-=367.9,右图为正离子模式[M+H]+=369.6,初步推断杂质分子量368.8) 药典中收载的关于杂质的分析方法很多都含有非挥发性盐类。赛默飞UltiMate 3000双三元液相色谱（DGLC）采用独特的双泵设计，每个泵可作为一个单独的体系，有各自独立的比例阀和流动相体系，可同时单独控制三种不同的流动相，在Chromeleon变色龙软件的支持下，结合独特的阀切换技术，通过灵活的流路连接设计，可以将流动相中的非挥发性缓冲盐在线去除。当您需要使用LC-MS联用技术对杂质进行进一步的深入研究时，赛默飞UltiMate 3000双三元液相色谱（DGLC）的流动相在线除盐技术，可让您永远不再为流动相中的非挥发性缓冲盐而烦恼。且该系统可同时实现在线富集、在线浓缩、在线净化等，可谓是最适合质谱使用的液相色谱仪。参考文献1、采用二维柱切换液质联用法对流动相进行在线除盐分析阿莫西林中有关物质2、采用二维柱切换液质联用流动相在线除盐分析头孢地尼中有关物质3、双三元液相色谱应用文集赛默飞创新技术应用系列之双三元液相色谱DGLC集锦（一）二维及全二维液相色谱分离技术应用（二）在线固相萃取技术（三）流动相在线除盐技术（四）在线柱后衍生和反梯度补偿技术关于赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（纽约证交所代码： TMO）是科学服务领域的世界领导者。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额130亿美元，员工约39,000人。主要客户类型包括：医药和生物技术公司、医院和临床诊断实验室、大学、科研院所和政府机构，以及环境与过程控制行业。借助于Thermo Scientific、Fisher Scientific和Unity&trade Lab Services三个首要品牌，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。我们的产品和服务帮助客户解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com 关于赛默飞世尔科技中国赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数超过2400名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有5家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在北京和上海共设立了5个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过400 名经过培训认证的、具有专业资格的工程师提供售后服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站：www.thermofisher.cn

本文来源： 柯瑞斯质谱平台摘 要目的　 建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时快速检测微量血清中维生素A、维生素D(25-OH-VD2、25-OH-VD3)、维生素E(α-、β-和γ-生育酚)的方法。 方法　 血清中脂溶性维生素经甲醇-乙腈(50:50, v/v)沉淀蛋白、正己烷萃取，以Phenomenex Kinetex F5色谱柱为分离柱，2.5mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相，梯度洗脱，电喷雾电离(ESI~+)、多反应监测(MRM)模式下检测，同位素内标法定量。结果　 血清中6种脂溶性维生素线性范围内线性关系良好，相关系数r0.995；6种脂溶性维生素的检测限为0.20～1.25ng/mL，定量限为0.39～3.88ng/mL；加标回收率为86.6%～107.7%，日内精密度9.6%，日间精密度9.3%。NIST标准参照品SRM 968f验证方法准确度，结果偏差均在5%以内。结论　 本方法准确度高、重现性好、用血量少，适于婴幼儿等采血困难者微量血样中多种脂溶性维生素的同时快速检测。正 文维生素在人体生长代谢过程中发挥着重要作用，是人体必须的微量营养素，缺乏或过量都会对人体健康产生不利影响。维生素A、D、E是脂溶性维生素，研究表明缺乏这些维生素会增加患夜盲症、骨质疏松、心血管疾病及免疫系统相关疾病的风险[1],婴幼儿及未成年人缺乏其对生长发育的影响则更为明显[2-4]。目前维生素检测的方法主要有高效液相色谱法[5-7]、液相色谱-串联质谱法[8-14]等，其中液相色谱-串联质谱法因其灵敏度高、重现性好、可同时快速检测多种维生素已成为很多临床实验室的首选方法。但是目前的液相色谱-串联质谱方法血液需求量较大[10,13],检测项目单一[8-9,14]或检测时间较长[11],不能满足临床同时快速检测多个项目的需求，特别是婴幼儿采血困难采血量很难满足需求。虽然已有部分学者建立微量检测方法用于维生素检测，但是这些方法需要衍生化过程，前处理复杂耗时较长[8-9,14]。因此，建立能够用微量血液同时快速检测多种维生素的方法满足临床不同年龄段的检测需求显得尤为必要。此外，视黄醇，维生素D的代谢产物25-OH-VD2、25-OH-VD3,α-生育酚是脂溶性维生素A、D、E在血液循环中的主要存在形式，常作为脂溶性维生素检测的首选指标[15-18]。γ-生育酚是维生素E主要的饮食摄入形式，但其与α-生育酚转移蛋白(α-TTP)的亲和力较低，在体内含量较α-生育酚低，但是，近年来文献报道其在人体健康活动中也扮演着重要角色[19]。本文建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时快速检测微量血清中视黄醇，维生素D(25-OH-VD2、25-OH-VD3)和α-、β-、γ-生育酚的方法，满足临床各年龄段尤其是对婴幼儿同时快速检测多种维生素的需求。１实验部分１.１　 仪器与试剂　液质联用仪；高速冷冻离心机；涡旋振荡仪；超声波振荡器；氮吹仪(Agela)；紫外分光光度计。视黄醇、25-OH-VD2、25-OH-VD3、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚均购自美国Sigma-Aldrich；视黄醇-d6标准品购自上海谱芬生物；25-OH-VD2-d3购自美国IsoSciences、25-OH-VD3-d6、α-生育酚-d6标准品购自加拿大TRC 血清质控样品购自美国NIST 收集安徽省第二人民医院近期健康体检正常儿童血液样本17份，避光保存。LC-MS级甲醇，色谱级乙腈、正已烷及甲酸均购自美国Fisher；甲酸铵、牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma-Aldrich；色谱级乙醇购自国药集团。实验用水由Milipore纯水仪(美国密理博)提供。１.２　 标准溶液和内标溶液的配制　 用无水乙醇配制视黄醇标准品储备液100μg/mL；α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚标准品储备液各1000μg/mL，并用紫外分光光度计对其浓度进行校正[18,20]。用甲醇配制25-OH-VD2标准品储备液25μg/mL和25-OH-VD3标准品储备液100μg/mL，视黄醇-d6标准品储备液100μg/mL，25-OH-VD2-d3标准品储备液50μg/mL，25-OH-VD3-d6标准品储备液50μg/mL，α-生育酚-d6标准品储备液1000μg/mL。将各目标化合物标准储备液用复溶液(初始流动相)稀释混匀，配制成混合标准溶液(视黄醇2.50μg/mL、25-OH-VD2 0.20μg/mL、25-OH-VD3 0.40μg/mL、α-生育酚50.00μg/mL、β-生育酚5.00μg/mL、γ-生育酚 5.00μg/mL)；将各同位素标品储备液用甲醇稀释混匀，配制成混合内标工作液(视黄醇-d6 2.00μg/mL、25-OH-VD2-d3 0.10μg/mL、25-OH-VD3 0.20μg/mL、α-生育酚-d6 20.0μg/mL)。取4g BSA溶解于100mL水中配成4% BSA溶液。１.３　 样本前处理　 取血清样品20μL至2mL离心管中，加入10μL同位素内标工作液，80μL水，2000r/min涡旋振荡30s后加入200μL甲醇-乙腈(50∶50,v/v)，2000r/min混匀60s；加入800μL正己烷，2000r/min，混匀5min，然后4℃，12000r/min离心5min；吸取600μL上清液至1.5mL离心管中，室温下氮气吹干；加100μL初始流动相复溶，涡旋振荡60s，4℃，12000r/min离心5min，上清液转移至进样瓶中待分析。１.４　 色谱 － 质谱条件　 采用Phenomenex Kinetex F5(100mm × 2.1mm, 2.6μm)色谱柱，柱温35℃，流动相A含2.5mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸的水溶液；流动相B含2.5mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱程序：0～2.0min，70%B，2.0～2.5min，70%～88% B，2.5～3.5min，88% B，3.5～3.51min，88%～81%B，3.51～11.0min，81% B，11.0～12.0min，81%～70%B，流速0.5mL/min。进样量：20μL。采用多反应监测(MRM)、电喷雾正离子模式(ESI+)，离子源温度 150℃，脱溶剂温度500℃，毛细管电压3kV，脱溶剂气流速1000L/h；6种脂溶性维生素的MRM 离子参数见表1。２　 结果与讨论２.１　 前处理条件优化　 对血清前处理过程中蛋白沉淀剂(甲醇、乙腈、乙醇)的选择及萃取溶剂正己烷的用量(400μL、600μL、800μL)进行了优化，结果表明，甲醇-乙腈(50∶50,v/v)，沉淀效果最好，色谱图杂峰明显减少；正己烷用量较大时萃取更完全，信号值更高。另外，考察了不同复溶液体系：甲醇-水(50∶50,v/v)、甲醇-水(70∶30,v/v)、甲醇均含2.5mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸对色谱分离的影响，结果如图1所示，使用b组复溶液即初始流动相时视黄醇响应值较a组增加1倍以上，c组视黄醇峰宽变大且峰形不对称。同时b组中25-OH-VD3和25-OH-VD2响应值是a组的2倍、c组的4倍以上，且峰形明显改善有利于25-OH-VD3和 25-OH-VD2的分离检测。最终，采用血清样加水混匀后用200μL沉淀剂(甲醇：乙腈(50∶50,v/v)沉淀蛋白，800μL正已烷液液萃取，取600μL上清液氮吹，初始流动相复溶进样。２.２ 　 液 相 色 谱 条 件 优 化 　 Kinetex F5色谱柱可以实现所有组分包括β、γ-生育酚的分离。此外，25-OH-VD3同分异构体3-epi-25-OH-VD3在婴幼儿体内含量较高，对维生素D含量测定影响较大[21]，该色谱柱可以实现25-OH-VD3和3-epi-25-OH-VD3的分离，减少3-epi-25-OH-VD3对检测结果的影响。故采用Kinetex F5色谱柱进行所有组分的分离(见图2)。研究发现在流动相中加入甲酸铵后其促进目标化合物离子化的效果较加入乙酸铵好，响应值增加明显，故在水相和有机相中均加入2.5mmol/L甲酸铵。２.３　 线性范围、检出限和定量限　 将混合标准溶液用复溶液逐级稀释，得到一系列标准工作液，各取20μL，分别加入10μL内标工作液和80μL 4% BSA溶液，其余操作同样本前处理。由于人血中存在内源性脂溶性维生素，故在标曲制作中加入4% BSA。以各目标化合物的色谱峰与其相对应的同位素内标色谱峰的峰面积比值-浓度比值作图，得到各目标化合物的标准系列工作溶液的直线拟合方程，并计算相应的线性相关系数。6种脂溶性维生素的标准曲线和线性范围见表2。结果表明，6种脂溶性维生素在对应的浓度范围内线性关系良好，相关系数0.995，标准溶液色谱图如图3所示。每个浓度重复检测6次，满足相对标准偏差20%且信噪比S/N≥3的最低浓度值定为检测限，满足相对标准偏差20%且信噪比S/N≥10的最低浓度值定为定量限。6种脂溶性维生素检测限为0.20～1.25ng/mL，定量限为0.39～3.88ng/mL(见表2)。２.４　 方法精密度　将低、中、高三个浓度标准品溶液加入4% BSA混合血清样本经本法处理后进行检测，每个浓度重复6次，连续检测三天，计算日内精密度为0.9%～9.6%，日间精密度为3.0%～9.3%(见表3)。该方法同时测定6种脂溶性维生素的日内精密度和日间精密度均在15%以内，方法精密度满足检测需求。２.５　 方法准确度　 将低、中、高浓度的标准品溶液加入混合血清样本中按本法进行前处理后进行检测，每个浓度重复6次，计算加标回收率，3个水平的加标回收率为86.6%～107.7%，相对标准偏差(RSD)为1.46%～9.39%(见表4)。该方法加标回收率均在80%～120%以内，方法准确度高满足检测需求。２.６　 方法验证　 采用建立的UPLC-MS/MS方法对美国国家标准技术研究所(NIST)制定的标准参照品SRM 968f进行检测，每个水平重复2次取平均值，验证方法准确度。结果表明，除25-OH-VD2含量较低未能检出外，其它检测结果与靶值偏差均在5%以内，该方法检测结果准确可靠(表5)。２.７　 实际样品测定　 使用本方法对17份健康儿童血液样本进行检测，其中视黄醇含量为0.22～0.43μg/mL，25-OH-VD2含量为未检出～5.19ng/mL，25-OH-VD3含量为6.83～49.21ng/mL，α-生育酚含量为5.63～12.73μg/mL，β-生育酚含量为0.03～1.37μg/mL，γ-生育酚含量为0.11～1.68μg/mL。本法适用于微量临床血液样本6种脂溶性维生素的同时快速检测。３结　 论本研究建立了超高效液相色谱串联质谱法同时测定微量血清样本中多种脂溶性维生素的方法，并对前处理过程中的蛋白沉淀试剂、萃取液用量，复溶液等进行了优化，以减少色谱图中噪音干扰，改善色谱峰形，提高检测灵敏度。并比较了不同色谱柱对多种脂溶性维生素尤其是不同类型维生素E的分离效果，最终选择Phenomenex Kinetex F5色谱柱，该色谱柱可以实现β-生育酚和γ-生育酚的有效分离。本研究中只需20μL血清就能够快速完成6种脂溶性维生素的测定。该方法测定样本需求量少、操作简单、检测结果准确快速可实现大量临床样本的同时检测，尤其对采血较为困难的婴幼儿可以实现少量血液样本检测多数项目的需求。参考文献（略）本文引用来源： 李雪梅,吴慧慧,陈竞,赵盼,唐玉菲.超高效液相色谱-串联质谱法同时快速检测微量血清中6种脂溶性维生素[J].现代预防医学,2022,49(07):1297-1302.