推荐厂家
暂无
暂无
白细胞与红细胞在此重新定向。白细胞(WBC)和红细胞(RBC)是血液中的重要组成部分,在生命体延续发展和生物治疗中具有不同的功能。红细胞,又称红血球,含有一种蛋白质称作血红蛋白。当血红蛋白从肺部吸收氧气时,血液呈红色。随着血液流经全身,血红蛋白向人体组织释放氧气。红细胞的生命周期为4个月,其形如圆盘,中间下凹,边缘较厚,呈圆饼状。白细胞,又称白血球,具有更加复杂的功能。白细胞构成了人体抵抗感染的一种防御机制。有多种不同类型的白细胞,其生命周期和功能各不相同。白细胞还能够产生一种特殊的蛋白质,称作抗体,能够识别并吞噬入侵人体的外来异物。 红细胞白细胞物理特征红细胞呈双凹圆盘状,无核。尺寸大约为6-8 μm。白细胞呈不规则性,但有一个核和外缓冲层。生命周期120天。几天,但在健康人体中可存活数天至数年不等。类型:血液中只有一种红细胞在血液中存在许多类型的白细胞,其功能各不相同:嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞(巨噬细胞)、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。循环系统:心血管系统。心血管和淋巴系统总计红细胞700:1白细胞男性每立方毫米460-6200万个;女性每立方毫米4200-5400万个。每立方毫米4000 – 11000个功能:向身体的不同部位提供氧气,并负责运送二氧化碳和其它废物。产生抗体,对感染形成免疫力,有些具有噬菌功能。血液中含量:
二、仪器、用品与试剂0.4 % w/v 台盼兰trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline 血球计数盘及盖玻片(Hem℃ytometer and coverslip) 计数器(counter) 低倍倒立显微镜 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 三、操作步骤(一)细胞计数3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100 倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色 ( 或红色- Erythrosin bluish) 。3.3. 计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypan blue等体积混合),最后乘以104 ,即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 3.4. 若不用血球计数盘,可用Coulter counter 作自动计数,惟无法辨别死细胞或活细 胞。然后按下式计算:细胞数/ml=4大格细胞总数x 2/ 4×10000注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占 10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。(二)细胞活力1、将细胞悬液以 0.5ml加入试管中。2、加入 0.5ml 0.4%台盼兰染液,染色 2一 3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用 。
液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤:(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项:(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。(4)冷冻保存之细胞浓度:①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。③adherent tumor lines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte须至少5×106cells/ml。(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。(6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤:(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。(4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理:(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料,如果细胞不易吸收trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。2、材料:0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。3、步骤:(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注:4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml计数板计数时,最适浓度为5~10×105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例:T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格:55,62,49,59;死细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2;细胞数/ml:60.75×104×2(稀释倍数)=1.22×106;细胞数/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106存活率:225/243﹦92.6%