使用SoftMax软件进行蛋白质检测- Molecular Devices SoftMax

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三三三蛋白质检测应用手册 对蛋白质进行准确灵敏的定量检测是很多研究的关键步骤。MD单功能或多功能微孔板读板机支持多种蛋白质检测分析方法。另外， SoftMax Pro软件能支持简洁明了、客户自定义的数据读取、分析和输出功能。 蛋白质检测应用手册手册内容 蛋白质免疫印迹检测. 2 GFP转染检测. 3 IMAP 激酶分析. 4 HTRF检测. 5 酶联免疫分析. 6 蛋白质亲和力分析. 7 其他检测... 8 蛋白 质 检 测 系 统 . 蛋白质免疫印迹检测 蛋白质免疫印迹法是一种检测特异蛋白的可靠方法。ScanLaterTM蛋白质质疫印迹检测系统提供了简便灵敏的蛋白质检测分析平台，具有更宽的动态检测范围和更低的背景，相比传统WB实验流程更简化，时间稳定性强，可多次重复检测。这一理想的WB检测系统可在SpectraMaxe i3 和 Paradigm@多功能酶标仪上使用。本研究显示出ScanLaterTM蛋白质免疫印迹检测技术相比传统化学发光法具有更强的灵敏度。 观看视频(链接)1http：//www.youtube.com/watch?v=_NpGOfmd414 下载应用提示(链接)http：//info.moleculardevices.com/acton/attachment/2560/f-0c7f/1/-/-/-/-/APP%20HIGHLIGHT--Detection%20and%20Quantitation%20of%20Protein%20with%20ScanLater%20Western%20Blot%20Detection%20System.pdf 下载海报(链接)http：//info.moleculardevices.com/acton/attachment/2560/f-0cb6/1/-/-/-/-/ScanLater%20Western%20Blot%20Poster.pdf GST (pg) InkDens- Back 7289 6991718 2430 4718568 810 1415489 270 396305 90 159105 30 87926 10 48473 3.3 29250 1.1 28298 0.4 15853 0.1 6869 上图：梯度稀释的GST蛋白(谷胱甘肽S转移酶)通过Spectra-Max Paradigm多功能酶标仪获得印迹图片。(注意：伪彩标尺用来显示大的动态检测范围)。下图：检测出每个条带的总体荧光强度，其整体动态范围为4个数量级，线性检测范围为3个数量级。 检测致癌物MMS和紫外辐射处理后HEK 293细胞中的磷酸化pChk1蛋白含量(Stanford University)。 WB结果用ScanLater系统进行扫描。 ScanLaterTM蛋白质免疫印迹技术与传统化学发光型蛋白质免疫印迹技术比较 MMS(PPM) 检测经不同浓度(0，50，100 ppm)致癌物MMS(一种烷基化试剂)处理后HEK 293细胞中的泛素化Rad-18蛋白。用ScanLater"蛋白质免疫印迹技术(左图)与传统化学发光型蛋白质免疫印迹技术(右图)检测结果进行比对。(Stanford University) GFP转染检测 荧光蛋白的表达，例如绿色荧光蛋白GFP，常被作为报告基因进行检测。常规报告基因检测法中，研究者感兴趣的目的基因序列与易于测定的报告基因序列相连接，能表达出融合蛋白。当GFP作为报告基因时，目的基因活性增强会同时提高细胞中GFP表达量， GFP表达可以被荧光酶标仪或者细胞成像系统检测到。 报告基因检测第一步需将介质DNA转染到真核细胞中。本研究展示了如何应用SpectraMax@ i3多功能酶标仪和SpectraMax@ MiniMaxTM 300田胞成像系统检测转染效率以及快速得到检测结果，转染是该实验成功的关键步骤。 下载应用提示(链接)http：//info.moleculardevices.com/acton/attachment/2560/f-0ea2/1/-/-/-/-/APP%20HIGHLIGHT--Optimizing%20GFP%20transfection%20with%20the%20SpectraMax%20i3%20Multi-Mode%20Detection%20Platform.pdf SpectraMax@ i3 多功能检测平台 ·易检测到转染和未转染细胞 ·能准确定量转染效率 ·转染前可先检测细胞生长饱和度 ·SoftMax Pro软件可快速分析报告基因检测结果 转染前用SpectraMax@ MiniMaxTM 300细胞成像系统检测细胞生长的饱和百分比。分别起始接种15000、10000、5000个细胞/孔，其对应细胞饱和百分比为44、30、15%。 成像系统检测GFP表达 用SpectraMax@ MiniMaxTM 300细胞成像系统对转染后细胞进行成像，然后用软件分类工具计算出GFP阳性细胞占总细胞数的百分比。 转染后细胞成像 GFP fluorescence 用SpectraMax@MiniMaxTM 300细胞成像系统的透射光(A， C)和绿色荧光通道(B，D)对转染细胞成像。 酶标仪多孔板读取GFP表达荧光强度 用SpectraMax@i3多功能酶标仪的荧光检测功能读取转染后细胞荧光强度。柱状图显示了每种转染条件下检测到的平均相对荧光强度。 IMAP激酶分析 蛋白激酶是多种细胞功能的调控中心。近年来他们逐渐成为疾病药物的最重要靶标之一，例如肿瘤等多种疾病。MD专利的IMAP@技术能快速高通量非放射性检测各种激酶活性，适用于检测方法开发及高通量筛选。本研究阐述了如何使用SpectraMax M5多功能酶标仪和SoftMax Pro软件进行IMAP荧光偏振激酶检测和校正曲线分析。 SpectraMax M5 多功能酶标仪： ·无需抗体 ·高强度荧光信号 ·通用分析平台 ·均相分析法 ·非放射性 ·可进行灵敏的FP和TR-FRET检测 IMAP-FP激酶分析 [Lck] (U/mL) 应用萤光素标记的p34cdc2蛋白衍生肽段(FAM-p34cdc2-derived peptide)作为底物得到酪氨酸激酶稀释效应曲线。SpectraMax M5多功能酶标仪对多孔板中浓度范围从0.04到3.5 units/mL的酶样品进行检测，得到毫偏值303(Z因子设为0.87)。 应用FAM标记肽段的Akt/PKBα激酶分析 00b6/1/-/-/-/-/IMAP%20FP%20Kinase%20Assasy%20on%20the%20SpectraMax%20M5%20Multi-Mode%20Microplate%20Reader.pdf 应用Tamra标记肽段的酪氨酸激酶分析 应用罗丹明染料标记的p34cdc2蛋白衍生肽段(TRMRA-p34cdc2-derived peptide)作为底物得到酪氨酸激酶稀释效应曲线，在M5酶标仪上进行检测(4参数拟合)。 应用底物FAM-Crosstide和抑制剂十字孢碱，在M5多功能酶标仪上检测，得到Akt1/PKBα激酶抑制曲线。SoftMax Pro软件能对数据进行本研究采用的5参数拟合。 HTRF检测 HTRF是用于检测生物分子之间的分子间相互作用的一个多功能技术。本实验应用cAMP dynamic 2 和 IP-One试剂盒得出了细胞实验与标准曲线的结果。 应用 cAMP dynamic 2试剂盒，通过Eu穴状化合物标记的抗cAMP单克隆抗体和d2标记的cAMP 联合检测cAMP 的水平。细胞天然产生的cAMP会与d2标记的cAMP竞争性结合抗cAMP穴状化合物抗体。如果检测到665nm处FRET荧光信号的减少，也就可以反推出细胞内cAMP水平的增加 应用IP-One试剂盒，同样的方式也使用特异于IP1的单克隆抗体，一个更稳定的下游代谢产物IP3可以在氯化锂的存在下对产生信号的细胞进行计数。在665 nm检测的荧光与在标准或细胞裂解液中的IP1浓度成反比。 这组HTRF数据展示了用SpectraMax M5e 多功能微孔板读板仪可以得到超宽的动态范围与卓越的Z'factors。 Download Application Note http：//info.moleculardevices.com/acton/attachment/2560/f-00b5/1/-/-/-/-/HTRF%20cAMP%20Dynamic%202%20and%20IP-One%20Assays%20Using%20the%2OSpectraMax%20M5e%20Multi-detection%20Microplate%20Reader.pdf IP1 cell-based assay Forskolin dose-response in CHO-M1 cells (Z'=0.86)，EC50=11.4 pM. Carbachol dose-response curve in CHO-M1 cells (Z'=0.91)，EC50=0.64 pM carbachol. IP1 standard curve cAMP standard curve (Z'=0.84)，EC50=6.3 nM. IP1 standard curve (Z'=0.84)， EC50=501 nM. 酶联免疫分析 随着光吸收法可以满足越来越多的应用检测领域，终点法读板机在实验室中的占有率也越来越高。例如应用ELISAs方法定量细胞因子和利用Bradford法进行蛋白定量检测。我们也通过应用ELISAs定量mouse/rat IL-22细胞因子的方法对EMax Plus单功能微孔板读板仪进行评估。 View Video http：//www.youtube.com/watch?v=q3AJ0cgQAvw Download Application Highlight http：//info.moleculardevices.com/acton/attachment/2560/f- 0c8f/1/-/-/-/-/EMax%20Plus%20Microplate%20Reader%20Application%20Highlight.pdf 标准曲线 IL-22 pgimL 应用R&Dmouse/rat IL-22蛋白定量检测ELISA系统通过终点光吸收法比较EMax Plus和EMax两台读板机的性能。然后，使用MultiWash+洗板机单排酶标条清洗模式进行双抗夹心ELISA实验，得出一条IL-22的标准曲线。 Step 1. SoftMax Pro实验设置 实验板设置模块指导客户一步一步设置实验。软件会自动识别连接的仪器。然后软件会应用预设的参数针对特定的仪器建立模板。针对本次设置， EMax Plus已被默认选择。 Step 2.板布局设置 用户可利用设置工具选择对应的样品和质控品孔。 EMax Plus 单功能微孔板读板仪·标配有8块滤片，应用范围更广泛简单易操作.·体积小巧 ·SoftMax Pro软件中含有预设模板 Step 3.数据获取和分析 Bradford实验的的预设参数可以自动根据板的数据计算拟合图表。 TEM-1抑制作用随着BLIP浓度增加的变化 反应是通过使用FlexStation 3多功能微孔板读板仪移液系统加入底物后完成的。动力学检测设置为一共检测200s，每次间隔1.84s。 TEM-1酶动力学和BLIP抑制剂的数据分析 计算初始速度，分子活性和传播误差。每个点都与传播误差的平方值成反比。 蛋白质亲和力分析 β-内酰胺酶抑制蛋白(BLIP)可以通过广泛的亲和力对多种A级β-内酰胺酶进行抑制。通过观察BLIP识别和抑制多种酶的能力，我们发现其对新型治疗方式有直接的影响。FlexStation 3多功能微孔板读板仪与其他方法相比，对于获取定量亲和力分析结果有很大的优势，比如进行β-内酰胺酶和抑制剂的蛋蛋的实验， TEM-1 和 BLIP。 Download Application Notehttp：//info.moleculardevices.com/acton/attachment/2560/f-0e97/1/-/-/-/-/B-Lactamase-Inhibitor%20Protein%20Binding%20Affinities--on%20FlexStation%203%20Microplate%20Reader.pdf Kinetics of inhibition of TEM-1 by BLIP 通过在酶标标的一列中加入浓度递增的BLIP，观察TEM-1酶动力学抑制作用的细节。加入底物前的基准线作为对照。相互独立运动的读头与移液器之间明显存在基线与初始底物加入后读取的间隔。插入包含时间点用于计算反应的初始速率。结果均由Flexstation 3多功能微孔板读板仪检测获得。 P1点的结合曲线和结果拟合具有相同的KD值。 空间邻近发光物的试剂捕获(SPARCL)是用来检测两个结合物特异性结合相互作用与协和作用的临近化学发光检测技术。通过在SpectraMax@ L微孔板读板仪上进行验证，证明SPARCLTM EIA试剂盒是一种均相实验，不需要固相支持就可以完成闪光型化学发光实验，脱离抗体孵育，洗涤等步骤，60分钟甚至更少的时间就可以完成整个实验。 Download Application Highlight http：//info.moleculardevices.com/acton/attachment/2560/f- 0d6e/1/-/-/-/-/App%20Highlight--Protein%20quantitation%20with%20SPARCL%20EIA%2OKit.pdf 均相化学发光酶免分析法 检测LPS刺激后THP-1细胞产生的IL-8含量 检测LPS刺激后THP-1细胞产生的IL-8含量的浓度效应曲线。IL-8检检测是通过使用96通量的SPARCL EIA试剂盒。利用SoftMax Pro 软件进行计算和绘制曲线下的RLU面积。(EC50=7.3 ng/mL and Z factor at EC80=0.93) SPARCL EIA试剂盒竞争实验-cAMP标准曲线 使用384通量的SPARCL EIA竞争性试剂盒， 在DPBS+0.1%BSA的条件下，绘制一条cAMP标准曲线。最终在SpectraMaxL微孔板读板仪上以每孔1s的速度读取曲线下的RLU面积。 蛋白质检测系统 For detailed information， select the images or text. SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform withScanLater Western Blot Detection Cartridge SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform with SpectraMax MiniMax 300 Imaging Cytometer SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate Reader SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader FlexStation 3 Multi-Mode Microplate Reader SpectraMax L Microplate Reader EMax Plus Microplate Reader MultiWash+Microplate Washer Molecular Devices 大中华区 Email：info.china@moldev.com www.MolecularDevices.com www.MolecularDevices.com.cn 上海 电话：86-21-33721088 传真：86-21-3372 1066 ( 北京 电话： 8 6-10-64108669 成都 电话：86-28-65588820 台北 电话：886-2-26567585 ) ( 传专：86-10-64108601 传真：86-28-65588831传真：8 8 6-2-28948267 传真：852-25644163 ) 香港 电话：852-29638040 地址：香港北角电气道148号37楼3705室 www.MolecularDevices.com/DetectProteins