在酶标仪上使用化学发光法检测细胞活性-Molecular Devices SpectraMax

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Molecular Devices 大中华区地址：上海市徐汇区宜山路1388号民润大厦8楼201103地址：北京市朝阳区永安东里16号CBD国际大厦901室100022地址：成都都市江区东御街18号百扬大厦2208室地址：台北市内湖区堤顶大道二段89号3楼 在SpectraMax@L和SpectraMax@'M5酶标仪上应用Promega CellTiter-Glo化学发光法 检测细胞活性 作者 Cathy Olsen， Ph.D.， MDS AnalyticalTechnologies，1311 Orleans Drive， Sunnyvale，CA 94089. 介绍 MD公司的SpectraMax@L及SpectraMax@M5型号酶标仪结合Promega公司的CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒能进行快速灵敏的活细胞数量测定。CellTiter-Glo检测法使用了萤光素酶，需要ATP使其反应发光。发光信号强度由ATP量决定，而ATP的多少取决于活细胞数目。SpectraMax@L及M5酶标仪均能提供96孔和384孔化学发光检测功能。 材料： >1.CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒(Promega公司，货号G7570)，包括CellTiter-Glo缓冲液和CellTiter-Glo底物(冻干粉) →CHO-K1细胞(ATCC，货号CCL-61) 一白色96和384孔板(Greiner Lumitrac200，货号655075和781075) > SpectraMax@L化学发光微孔板检测仪或SpectraMax@M5多功能微孔板读板机 方法准备CellTiter-Glo试剂 使用前将CellTiter-Glo缓冲液和底物在室温中平置解冻。然后将缓冲液倒入装有底物的棕色瓶中，并按照CellTiter-Glo操作手册中指示，温和颠倒瓶子以混匀。 细胞计数及产生发光信号 用含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的Ham'sF12培养基培养CHO-K1细胞。胰酶消化后使细胞悬浮在培养基中，并进行细胞计数。用96孔板检测时，每孔中加入100ul细 胞悬液，细胞浓度从50000个/孔稀释到24个/孔。384孔进行检测时，每孔中加入25ul悬液，细胞浓度从12500个/孔稀释到25个/孔。空白孔中加入不含细胞的培养基，用于检测背景光值。 为了确保CellTiter-Glo检测中细胞数量的准确性，细胞不能贴壁和生长，但能及时被检测到。每孔中加入100ul(96孔板)或25ul(384孔板)CellTiter-Glo试剂。然后将微孔板放在振荡器上温和振荡混混2分钟，室温孵育10分钟，使其产生稳定的发光信号。 制作ATP标准曲线 ATP标准样品用培养基制备，浓度范围从100fmol/孔到1nmol/孔(96孔板)， 或25fmol/孔到250pmol/孔(384孔板)，按上述同样体积加入微孔板中。空白对照孔加入不含ATP的培养基。适量CellTiter-Glo试剂加入每孔，并按上述步骤孵育。 仪器设置和样品分析 检测板用SpectraMax@ L和SpectraMaxeM5酶标仪进行读数，并使用SoftMax@ Pro软件中预设参数的CellTiter-Glo模板。根据Promega推荐，检测时间设置为1秒。然后在SoftMax@ Pro软件上进行平均发光强度和标准偏差计算，细胞浓度稀释曲线和ATP标准曲线作图。 结果 SpectraMax@L和SpectraMax@ M5酶标仪均最低能检测24个细胞/孔(96孔板)和6个细胞/孔(384孔板)。因此其灵敏度高于比色法和荧光检测法。CellTiter-Glo化学发光检测值在所用的细胞浓度范涯内呈线性分布，并达到大于3个数量级的动态范围(r2=0.99)。(见图1) ATP标准曲线能用于验证试剂盒以及计算细胞ATP含量。ATP标准曲线中ATP浓度范围对应检测值覆盖了细胞数量检测中的发光值全部范围(见图2)。检测值至少在4个数量级范围内呈线性。 结论 SpectraMax@L和SpectraMax@M5酶标仪均为CellTiter-Glo检测提供了优异的检测灵敏度。SpectraMax@L化学发光读板机带有自动增益功能，能同时进行模拟信号和光子计数，提供大于9个数量级的动态范围，对于高信号值样品无需稀释，同时对于低信号样品具有优越的灵敏度。 SpectraMax@M5多功能读板机为使用者提供了除化学发光以外的其他检测方法，例如：光吸收，荧光强度，荧光偏振和时间分辨荧光。 SpectraMax@ L和SpectraMax@M5酶标仪均用SoftMax@ Pro软件进行操控和设置，该软件含有CellTiter-Glo检测模板和其他120多个分析模板，这些模板已预设参数，方便数据整理和分析。两种酶标仪均能整合MD公司的StakMax@微孔板移动机械臂，以实现微孔板的自动装卸。 细胞数量与发光值相关性(图1) Cells/Well Cells/Well A：用SpectraMaxL酶标仪检测系列细胞稀释浓度下CellTiter-Glo发光值 B：用SpectraMax@M5多功能酶标仪检测系列细胞稀释浓度下CellTiter-Glo发光值 其中，蓝色代表96孔板，红色代表384孔板，各曲线均r?=0.99 ATP标准曲线(图2) 3 ATP标准品使用96孔板(蓝色)和384孔板(红色)在SpectraMaxL酶标仪上进行化学发光值检测。两条曲线均r2=0.99。在SpectraMax@M5酶标仪上得到了相似的检测结果(未显示)。