水中微生物抗药性检测方案(接种仪)

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水环境中微生物耐药性的检测 近年来，医药行业为牟取暴利，畜牧水产养殖业为增产而大量使用抗生素，现有研究表明：多数药物在人以及动物机体内并不能被完全代谢，多数以原形和活性代谢产物的形式通过粪便排到体外。这些物质最终会通过医院污水、城市生活污水、牲畜粪便以及医药工业废水等多种途径进入水环境造成污染。水环境抗生素污染最有可能产生的影响是其持续低水平的暴露对水生生物的远期毒性作用和对微生物群落产生的抗生素耐药性，耐药性生物以及耐药因子可经多途径侵入机体，将耐药性传递给体内致病菌，加大感染性疾病的治疗难度。 本文以耐热性大肠菌群（粪大肠菌群）为指示菌，对水体中微生物对十种常用抗生素的耐药性进行了初步研究。 1 水样采集 采样按照无菌操作进行，用经过200℃高温干烤2h后包裹于灭菌牛皮纸袋的500ml棕色采样瓶进行采样，各水样采集平行样三份，每份采样量500目录。样本置于放有冰块的冷藏箱中运会实验室4℃保存，6h内进行过滤。 2 菌株分离 2.1 实验步骤 参照美国《水和废水标准检验法》中的滤膜法在6h内对水样中的耐热大肠菌群进行检测分离。不同地区水样所需过滤体积不同，各水样过滤体积为：医院污水排放点地表水和污水处理厂进场水0.001ml，污水处理厂出厂水样0.01ml，屠宰场下游地表水0.1ml，畜禽养殖基地地表水以及普通生活区域地表水1ml，山泉水100ml。 除山泉水直接过滤外，其他水样在100ml无菌缓冲稀释液中充分混匀后用口径为47mm的过滤器经滤膜过滤。对每批水样进行过滤时都以100ml灭菌稀释缓冲液作为空白对照。滤膜截留面向上，以滚动方式置于m-FC平板上（染料组分苯胺蓝替换为甲基蓝），于37℃进行5h的复苏培养后转至44.5℃培养19h。对滤膜上典型蓝色菌落数为20-60的平板上的菌落进行计数，计算耐热大肠菌群平均密度（cfu/100 cm）。用无菌接种针随机挑取各类邢台的蓝色菌落5个用标准计数培养基平板划线法接种纯化，纯化菌株接种于半固体培养基37℃培养24h后置于4℃保存备用。 2.2 所用主要仪器 2.2.1 多联过滤器 全部采用316L不锈钢材质，根据316L不锈钢的物理性质，此仪器的特点是耐腐蚀性较为突出，对除高浓度的高氧酸外均有良好的抗腐蚀性，可在800℃下连续使用，滤头和支架可拆卸，消毒方便。可采用煤油喷灯进行消毒。每个烧结虑头都有控制阀单独控制，滤杯底口内径38mm，可与Φ50mm的虑膜配套使用。杯盖可连接空气过滤装置，防止空气二次污染。 此款过滤器可同时过滤三个样品，增加实验的平行性以及可重复性。 2.2.2 多点接种仪 我公司自主研发的HMI-60＆24多点种仪为细菌耐药性实验-琼脂法专用仪器，可以在9秒钟内自动进行并完成接种，打破了传统人工接种模式，采用机械接种，使接种过程简单、快速，准确。 可自动化的同时接种24个或者60个样品，实现了实验过程的自动化，同时避免操作误差。 2.2.3 菌落计数器 此款菌落计数器HCC-01为半自动点击式计数，内置平均数计算系统，具有归零功能；      LED照明，保护您的眼睛，可选择明暗视野背景，光学放大3X、6X； 适用于任何探针式触笔，压力敏感和计数声响均可调节，操作方便； HCC-02可连接电脑，显示记录参数； 3 菌种鉴别 所有分离菌用微生物分析系统、试剂盒进行菌种鉴定。基本过程是：纯化菌株→ 制备菌悬液→ 准备并接种实验条→结果判读→鉴定。 4 药物敏感性试验 采用方法为琼脂扩散法，选择医疗和畜禽养殖常用的10种抗生素进行药物敏感性试验。抗生素种类及其抗生素含量为：青霉素（PEN, 10IU/片），氨苄西林（AMP ,10ug/片），头孢他啶（CEF，30ug/片），庆大霉素（GM，10ug/片），丁胺卡那霉素（AMI，30ug/片），红霉素（EM，15ug/片），链霉素（SM，10ug/片），环丙沙星（CIP，5ug/片），氧氟沙星（OFL，5ug/片），诺氟沙星（NOR，5ug/片）。质控菌株为埃希氏大肠杆菌。 实验具体步骤如下： 4.1 接种、活化菌种。 将保存在试管内的菌种用灭菌后的接种环挑取少许，用“三线法”接种于普通羊血平板上，置于35℃电子恒温孵育箱培养18h得到经活化后的目的菌种。 4.2 制备菌悬液。 用灭菌后的接种环从上述平板上挑取乙腈分纯的单个菌落2-3个，小心的放在约含2ml无菌生理盐水的试管管壁内，缓慢的将细菌研磨均匀并与无菌生理盐水充分混匀，即可得到菌悬液，最后用电子比浊气测定菌悬液的浊度，本次试验所有菌悬液均需调整为0.5麦氏单位。 4.3 接种M-H平板。 制备好的菌悬液必须在15min内使用。用灭菌的棉拭子蘸取菌液在管壁上旋转挤压3次，去掉多余的菌液。用该棉拭子涂布整个M-H培养基表面，反复4次，每次将平板旋转60度，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。 4.4 贴药敏药片。 待平板上的水分被琼脂完全稀释后用镊子取药敏纸片一片贴在琼脂平板表面，用镊子尖稍稍压平。每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。直径为90mm的M-H平板贴5张，贴完纸片后在15min内将平板反转，置于35℃孵育箱中培养18-24h后观察结果。 4.5 判断结果。 孵育18-24h后，检查每块平板，如果平板划线满意，接种无准确无误，抑菌圈应为正圆形，菌落应相互融合生长。抑菌圈的边缘以细菌明显生长为限，测量包括纸片在内的完全抑制区域直径。 统计结果，得出水环境中微生物细菌的耐药性情况。 www.tjhakj.com www.tjhakj.com www.tjhakj.com www.tjhakj.com