洋川芎内酯和藁本内酯中含量分析检测方案(制备液相色谱)

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药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(1)—69 川芎中洋川芎内酯A和Z-藁本内酯的分离提取及鉴定 胡杨，刘春明**，胡蕴梅，马冰，张语迟 (长春师范学院中心实验室，长春130032) 摘要 目的：应用中压柱色谱分离提取川芎中2个主要内酯类化合物，并对其进行定性检测和结构鉴定。方法：利用中压柱色谱分离内酯类化合物，采用120g Biotage SNAP Cartridge KP - C18-HS色谱柱，以乙腈-0.5%醋酸作为中压柱色谱分离的溶剂体系，流速30 mL·min，检测波长280nm，柱温30℃，进样量800 mg；利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术进行定性检测和结构鉴定，采用 SunFireCig(250 mm×4.6 mm，5 pm) 反相色谱柱，流速0.5 mL·min，正离子模式电喷雾电离，扫描范围m/z 50~1000，喷雾电压4.5 kV，金属毛细管温度250℃，金属毛细管电压20V。结果：应用中压柱色谱技术一次性从800 mg 川芎的60%乙醇提取物中分离得到2个单体化合物，洋川芎内酯 A( 11.3 mg) 和Z-本内酯(20.1 mg)，其纯度均达到95%。结论：应用中压柱色谱分离川芎中单体化合物洋川芎内酯A和Z-薰本内酯的方法简单、快捷。 关键词：中压柱色谱；川芎；洋川芎内酯 A；Z-本内酯；内酯类化合物；高效液相色谱-电喷雾质谱联用；结构鉴定 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2013)01-0069-04 Separation， extraction and identification of senkyunolide A andZ-ligustilide in Chuanxiong Rhizoma HU Yang， LIU Chun - ming**， HU Yun- mei， MA Bing， ZHANG Yu -chi( Central Laboratory， Changchun Normal University， Changchun 130032， China) Abstract Objective： To separate and extract two main lactones from Chuanxiong Rhizoma by medium -pressureliquid chromatography(MPLC)， and perform the qualitatively detection and structural identification of the constitu-ents. Methods： A 120g Biotage SNAP Cartridge KP - C18 -HS column was employed as the separation column；solvent system of acetonitrile -0.5% acetic acid was used for MPLC at the flow rate of 30 mL· min；UV detec-tor was set at 280 nm， and the temperature was 30 ℃； sample volume was 800 mg. The qualitative and quantitativemeasurement and structural identification were carried out by high performance liquid chromatography - electrosprayionization mass spectrometry using a SunFire Cig reversed - phase column(250 mm×4.6 mm， 5 um， Waters，USA)， the flow rate was 0.5 mL· min. The mass spectrometer was used to scan molecular weight units from m/z50 to 1000 with the full scan and positive ion mode， spray voltage was 4.5 kV， capillary temperature was 250℃，and capillary voltage was 20 V. Results： Two individual compounds senkyunolide A(11.3 mg)and Z-ligustilide(20.1 mg) were separated from 800 mg of 60% ethanol extract of Chuanxiong Rhizoma via one -step MPLC sepa-ration with a purity of more than 95%. Conclusion： The MPLC method has the advantages of simpleness and effec-tiveness for the separation of senkyunolide A and Z -ligustilide from Chuanxiong Rhizoma. Key words： medium-pressure liquid chromatography； Chuanxiong Rhizoma； senkyunolide A； Z-ligustilide； lac-tones； high performance liquid chromatography - electrospray ionization mass spectrometry； structural identification 川芎为伞形科形本属植物川芎Ligusticum chua-nxiong Hort. 的根茎，始载于《神农本草经》。其性温，味辛，微苦，具有活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛 等功效"。研究表明，川芎的主要活性成分包括酚酸类(如阿魏酸、棕榈酸、亚油酸等)、内酯类(如葉本内酯、洋川芎内酯、蛇床内酯等)和生物碱类(如川芎 ( 国家自然科学基金项目(30970299)；国家自然科学基金资助项资(31170326) ) ( ** 通讯作者 Tel：(0431)86168777；E- mail： ch u nmingliu2000@ yahoo. com. c n ) 嗪、胆碱等)2-3]，其中洋川芎内酯 A( senkyunolideA)和Z-一本内酯( Z -ligustilide)(如图1)含量最高“，研究表明，葉本内酯能明显解除乙酰胆碱、组胺以及氯化钡引起的气管平滑肌痉挛收缩。 图1 洋川芎内酯A和Z-薰本内酯的结构 Fig 1 The structures of senkyunolide A and Z -ligustilide 本实验采用高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC -ESI/MS) 联用技术，对中压柱色谱分离得到的川芎有效成分进行了定性分析和结构鉴定研究。实验表明该方法可以快速分析鉴定川芎中洋川芎内酯A和Z-本内酯并提供结构信息。 1仪器与试剂 LCQ FLEET 离子阱型串联液质联用仪(美国Thermo Fisher 公司) ； Waters e2695 高效液相色谱仪(美国， Waters 公司) ，PAD-2998 二极管阵列检测器(美国， Waters 公司)， SunFireM Cg(250 mm×4.6 mm，5 pm)反相色谱柱(美国 Waters 公司)；Isolera快速制备色谱仪(瑞典 Biotage 公司) ，120gBiotage SNAP Cartridge KP -C18 -HS 色谱柱(瑞典Biotage 公司)。 D101 型大孔吸附树脂柱(天津南开大学化工厂)，Sartorius BSl10S分析天平(十万分之一，北京赛多利斯有限公司)。 HPLC 流动相所用乙腈和醋酸为色谱纯(美国 Ther-mo Fisher公司)，实验用水为实验室自制超纯水，其他试剂均为分析纯(北京化工厂)。川芎药材购自北京同仁堂长春店，由长春师范学院张语迟鉴定为伞形科藁本属植物川芎 Ligusticum chuanxiong Hort. 的干燥根。 2 分离试验用粗提物的制备 称取川芎药材200 g，粉碎，过40目筛，用15倍量的60%乙醇溶液回流提取2次，每次1h，合并滤液，减压浓缩至浸膏，上D101型大孔吸附树脂柱，先用5倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去，再用5倍柱体积60% 乙醇溶液洗脱，收集滤液，减压浓缩，冻干，得到川芎粗提物粉末，备用。 3 LC条件及 MS 条件 3.1 中压柱LC条件采用120g Biotage SNAP Car-tridge KP -C18 -HS色谱柱(瑞典 Biotage 公司)，流动相为0.5%醋酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(先用13%B平衡 15 min；0~40 min，13%B→100%B；40~50 min，100%B)，流速 30 mL·minn，检测波长280 nm，柱温30℃，进样量800 mg. 3. 2 HPLC -ESI/MS 条件 LC条件：采用 SunFireC g(250 mm×4.6 mm，5 um)反相色谱柱(美国 Waters公司)，流动相为0.5%醋酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0~2 min，13% B； 2~60 min，13%B→80% B；60~90 min，80%B→100%B)，流速0.5 mL· min，测波长280 nm，柱温30℃，进样量10p.L。 MS条件：正离子模式电喷雾电离，扫描范围 m/z 50~1000；离子阱条件：喷雾电压4.5kV；鞘气、辅助气为氮气，金属毛细管温度250℃，金属毛细管电压20V。 4 分离结果 精密称取按“2”项下方法制得的川芎粗提物粉末800 mg，用5mL 甲醇溶解，过0.45 pm微孔滤膜，制得供试样品溶液，采用“3.1”项下的中压柱色谱条件进行中压柱色谱分离(图2)，40 min 之内出10个色谱峰，分别对应收集流出液。采用“3.2”项下的 LC 条件对峰1~峰10进行测定，其中峰8(11.3 mg) 和峰9(20.1 mg) 的纯度达95%以上(图3)，根据已有文献[6]的 LC 条件来初步确定成分，峰8为洋川芎内酯A，峰9为Z-葉本内酯。 图2 川芎中压柱色谱技术分离结果 Fig 2 Medium pressure column chromatography result of the separation of Chuanxiong Rhizoma 图3 洋川芎内酯A(a)和Z-葉本内酯(b)的高效液相色谱图 Fig 3HPLC chromatograms of senkyunolide A(a) and Z -ligustilide(b) 5 结构鉴定 洋川芎内酯A：在ESI*模式下，t=51.17 min的峰8的一级质谱产生了 m/z 193、147和215等离子(图4)，其中m/z 193 [M+H]*为准分子离子峰，m/z 215 为[M+Na]*的加合离子，对 m/z 193 进行MS分析，得到 m/z 175、147、137、105和91等离子。m/z175为[M-H，0+H]+离子，m/z 147 为M-H，0-CO+H]*离子，m/z 137 为[M-CH+H]*离子，m/z 105 为[M -H，0-CO-C，H6+H]*离子，且峰8的紫外最大吸收波长为280 nm，参考文献[7]证明峰8为洋川芎内酯A。洋川芎内酯A主要以侧链断裂脱烯(CHn)和开环脱水再脱羰基(H，0+CO)2种途径进行碰撞裂解(图5)。 图4 洋川芎内酯A的MS图( a) 和 MS/MS图(b) Fig 4 MS( a) and MS/MS(b) results of senkyunolide A 0H -CHs OH m/z 193 m/z 137 (a) Side-chain cleavage pathways of senkyunolide A (b)Ring-opening pathways of senkyunolide A 图5 洋川芎内酯A的碰撞裂解途径 Fig 5 The collisional fragmentation pathways of senkyunolide A a. 侧链断裂脱烯( side - chain cleavage) b. 开环脱水再脱羰基(ring-opening) Z-本内酯：在ESI*模式下，=57.09 min的峰9的一级质谱产生了 m/z 191、381和403等离子(图6)，其中 m/z 191[M+H]*为准分子离子峰，m/z 381 为 [2M+H]*的葉本内酯二聚体离子，m/z 403为 [M+Na]*的葉本内酯二聚体加合离子，对 m/z 191 进行 MS分析，得到m/z 173、163、149、145、135、117、105和91等离子。m/z173为[M-H0+H]*离子，m/z 163 为[M -CH4+H]*离子，m/z 149 为 [M-CH+H]+离子，m/z 145 为 [M -H，0- CO+H]*离子，m/z135为 [M-C Hg+ H]*离子， m/z 117 为[M-H，O-CO-CH+H]*离子，m/z105为[M -H，0-CO-C，Ha+H]*离子，且峰9的紫外最大吸收波长为280 nm 和330 nm，参考文献[8]证明峰9为Z-葉本内酯。Z-藁本内酯主要以侧链断裂脱烯(CH)和开环脱水再脱羰基(H，0+CO)2种途径进行碰撞裂解(图7)。 6 结论 采用乙腈-0.5%醋酸作为中压柱色谱分离的溶剂体系，一次性生800 mg川芎的60%乙醇提取物中快速分离了2个内酯类单体化合物，并利用 HPLC -ESI/MS 联用技术进行定性检测和结构鉴定。结果表明，2个内酯类单体分别为洋川芎内酯A( 11.3 mg) 和z-本内酯(20.1mg)，且纯度均达到95%，与薄层色谱和高速逆流色谱等分离技术相比，中压柱色谱技术具有进样量大、分离时间短等优点，可以作为分离天然产物的主要手段。 图6 Z-一本内酯的 MS 图( a)和 MS/MS图(b) Fig 6 MS(a) and MS/MS(b) results of Z -ligustilide -CH4(a)Side-chain cleavage pathways of Z-ligustilide0H H-H，0=0 -= (b)Ring-opening pathways of Z-ligustilide 图7 Z-葉本内酯的碰撞裂解途径 Fig7 The collisional fragmentation pathways of Z -ligustilide a.侧链断裂脱烯( side-chain cleavage) b.开环脱水再脱羰基(ring- opening) ( 参考文献 ) ( 1 L I U Wen(刘雯) ，WU P i ng -li(吴平丽) ， Z HUO Chao( 卓超)，et a l . ) ( One step separation a nd preparation o f senkyunolide A a n d Z-ligusti-lide in Ligusticum chuanxiong Hort. b y high s peed c o unter c u rrent chromatography(应用 高 速逆流一次性分离川芎中的蛇床内酯A 和 Z-一本内酯). 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Identification and cha r acterization of supercritical fluid ex- tracts of Rhizoma Chuanxiong by h i gh p e rformance li q uid c h romatog- raphy -ion trap mass spectrometry(中药川芎超临界 COz提取液的 液相色谱-电喷雾多级质谱研究). J Instrum Anal(分析测试学 报)，2007，26(3) ： 356 ) ?China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net Separation，extraction and identification of senkyunolide A andZ － ligustilide in Chuanxiong Rhizoma*HU Yang，LIU Chun － ming＊＊，HU Yun － mei，MA Bing，ZHANG Yu － chi( Central Laboratory，Changchun Normal University，Changchun 130032，China)Abstract Objective: To separate and extract two main lactones from Chuanxiong Rhizoma by medium － pressureliquid chromatography( MPLC) ，and perform the qualitatively detection and structural identification of the constituents．Methods: A 120g Biotage SNAP Cartridge KP － C18 － HS column was employed as the separation column;solvent system of acetonitrile － 0. 5% acetic acid was used for MPLC at the flow rate of 30 mL·min － 1 ; UV detectorwas set at 280 nm，and the temperature was 30 ℃; sample volume was 800 mg． The qualitative and quantitativemeasurement and structural identification were carried out by high performance liquid chromatography － electrosprayionization mass spectrometry using a SunFireTM C18 reversed － phase column( 250 mm × 4. 6 mm，5 μm，Waters，USA) ，the flow rate was 0. 5 mL·min － 1 ． The mass spectrometer was used to scan molecular weight units from m/z 50 to 1000 with the full scan and positive ion mode，spray voltage was 4. 5 kV，capillary temperature was 250 ℃，and capillary voltage was 20 V． Results: Two individual compounds senkyunolide A( 11. 3 mg) and Z － ligustilide( 20. 1 mg) were separated from 800 mg of 60% ethanol extract of Chuanxiong Rhizoma via one － step MPLC separationwith a purity of more than 95%． Conclusion: The MPLC method has the advantages of simpleness and effectivenessfor the separation of senkyunolide A and Z － ligustilide from Chuanxiong Rhizoma．Key words: medium － pressure liquid chromatography; Chuanxiong Rhizoma; senkyunolide A; Z － ligustilide; lactones;high performance liquid chromatography － electrospray ionization mass spectrometry; structural identification