多糖中糖醛酸检测方案(毛细管柱)

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安捷伦 6890 气相色谱法测定多糖中的糖醛酸 分析检测糖醛酸的方法有比色法、纸色谱法、气相色谱法 (GC)和高效液相色谱法等。因为多糖中与糖醛酸相邻糖单位间的糖苷键难以被酸水解，而且糖醛酸一旦被释放出来，容易发生内酯化，且内酯化程度难以重复，所以对糖醛酸的分析检测比较困难。吴昌贤等先将样品中的糖醛酸内酯转化为糖醛酸，然后用阴离子交换树脂将糖醛酸的还原产物糖醇酸与糖的还原产物糖醇分开，将糖醇酸内酯化后再进行三甲基硅醚衍生化，最后用GC 分析。Nishide 等将糖醛酸内酯转化成糖醛酸后，不经还原，直接用离子交换树脂将糖醛酸与中性糖分离，其余操作与吴昌贤等人的方法相似。本文先将多糖样品中的糖醛酸进行羧基还原，使糖醛酸还原为相应的中性糖，然后将中性糖的糖腈乙酰化衍生物用 GC进行分析，通过比较羧基还原前后中性糖的变化，推算出糖醛酸的组成。 15实验部分 1.1材料 多糖样品为羊栖菜褐藻糖胶。羊栖菜是褐藻门马尾藻科植物，采自浙江洞头县。藻粉经热水提取和 CaC12 纯化后得褐藻糖胶。褐藻糖月经 DEAE Sepharose CL-6B 柱色谱和 Sepharose CL-6B 柱色谱分离， 得到一组分(命名为F32)，其化学组成为：总糖57.4%，硫酸基25.1%，糖醛酸21.8%(咔唑比色法测定，以葡萄糖醛酸计)。 1.2仪器与试剂 Agilent 6890 气相色谱仪，氢火焰离子化检测器， HP-1毛细管柱：：230m×0.32mm i.d.×0.25um。标准单糖 (Sigma公司)，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚(简称EDC， Fluka 公司)，其余试剂均为分析纯。 1.3羧基还原 称取 30mgF32，进行羧基还原后得干燥产物 29mg，，命名为RF32. 1.4 F32 和 RF32 的水解和衍生化 分别别取 5mg 的F32和RF32，各加2mL 2mol/L三氟乙酸，于121℃下水解 1h。将水解液于40℃下减蒸蒸发至干后，进行糖腈乙酸酯衍生化。 1.5中性糖的气相色谱分析 2结果与讨论 2.1L糖醛酸的羧基还原 F32经羧基还原后，咔唑比色法显示糖醛酸的含量几乎为零，表明多糖中的糖醛酸都已被还原为相应的中性糖，因而可以进行下一步的分析。 2.2 F32 和RF32 的中性糖组成 表1显示， RF32 中葡萄糖含量很高，甘露糖含量也明显增加，而其余几种糖则基本保持不变，说明葡萄糖和一部分甘露糖是由葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸转化而来的。 2.3糖醛酸组成的计算 F32中的主要单糖是岩藻糖，它是6位脱氧己糖，不能形成糖醛酸，因此以岩藻糖作为比较的基准物。羧基还原前后葡萄糖、甘露糖和半乳糖与岩藻糖的比值见表2，可将中性糖与岩藻糖比值的增加量看作是由糖醛酸转化为相应的中性糖引起的。与 F32 相比， RF32中葡萄糖与岩藻糖的比值增加了1.227，甘露糖增加了0.370，而半乳糖基本不变。 这表明 F32 中的糖醛酸为葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸，其中葡萄糖醛酸的比例为1.227/(1.227+0.370)×100%=76.8%，甘露糖醛酸的比例为0.370/(1.227+0.370)×100%=23.2%。 2.4讨论 用GC分析褐藻糖胶中的糖醛酸组成，结果不理想，糖醛酸未能检测出来。而用高效液相色谱法分析糖醛酸组成需脉冲安培检测器，对仪器的要求较高。与以前的 GC 法相比，本方法操作简单，容易控制，而且糖醛酸还原后多糖的水解也变得容易。此外，本法不需要糖醛酸标准品，且只需一种衍生化试剂，因而成本相对较低。本文虽然只用了一种酸性多糖作为样品，但从理论上说该法也适用于其他种类的酸性多糖。综合考虑，本法不失为一种分析多糖中糖醛酸组成的较好的方法。 本文先将多糖样品中的糖醛酸进行羧基还原，使糖醛酸还原为相应的中性糖，然后将中性糖的糖腈乙酰化衍生物用GC进行分析，通过比较羧基还原前后中性糖的变化，推算出糖醛酸的组成。重要仪器及试剂：Agilent 6890 气相色谱仪，氢火焰离子化检测器，HP-1 毛细管柱：30m×0.32mm i.d.×0.25μm。标准单糖（Sigma公司），1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（简称EDC，Fluka公司），其余试剂均为分析纯。