鳗鱼中沙星类化合物残留检测方案(固相萃取仪)

智能文字提取功能测试中

自动化样品前处理解决方案-RK-2020 Knowledge Optimized Laboratory 解决方案 鳗鱼中沙星类化合物残留的测定 关键字 全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；沙星类化合物 介绍 沙星类 (Quinones，(QNs)抗生素(图-1)是一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小、价格低廉等特点，被大量用于治疗和预防水生动物疾病及促生长。 图-1.16种沙星抗抗生素的结构式 本方案参考农业部1077号公告-1-2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留的测定液相色谱-串联质谱法》，采用酸化乙腈对目标化合物进行提取。由于标准中只进行了简单的除脂，提取液中仍含有大量的样品基质，容易干扰后续的液质测试。所以本方案采用HLB柱对提取液进行净化，使得整个检测结果更加具有平行性与可靠性。 1.仪器和耗材 仪器 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 Raykol AH-30 全自动均质器 Raykol MPE-16 高通量真空平行浓缩仪 高效液相色谱(HPLC) Agilent 1260， 质谱检测器(MS) Agilent 6410 或相当 Raykol Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪 耗材 HLB固相萃取柱 (RayCure HLB， 500mg/6mL，试剂 货号：RC-204-36477) 甲醇(优级纯)，水。 Na，EDTA (0.1 mol/L) -MCIlvaine (0.1M)缓冲溶液(pH4.0)，准确60.2g乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钠17.8 g和柠檬酸21.0 g与烧杯中，加标准曲线配制 入1000 mL 的纯净水，加入浓盐酸调节 pH值至4.0.如果该缓冲液在放置过程中易析出晶体，那么请将浓度减半进行配制。 将1000.0 Hg/mL 的单标储备液取出，于室温平衡后用 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作 站配成浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 Hg/mL的标准工作曲线。 序号 命令 源液位 源液浓度 源液体积(mL 目标位 目标浓度 目标体积(mL3.00 溶剂 洗针溶剂 1 填充管路 10%乙腈水 2 配液 A1-16 1000.00 1.50 A21 10.00| 1.00 10%乙青水 10%乙腈水 3 直接稀释 A21 10.00 1.00 A22 1.00 1.00 10%乙腈水 10%乙腈水 4 直接稀释 A22 1.00 1.00| A31 0.01 1.00 10%乙腈水 10%乙腈水 5 直接稀释 A22 1.00 1.00| A32 0.02 1.00 10%乙青水 10%乙腈水 6 直接稀释 A22 1.00 1.00| A33| 0.05 1.00 10%乙腈水 10%乙腈水 7 直接稀释 A21 10.00 1.00| A34| 0.10 1.00 10%乙青水 10%乙腈水 8 直接稀释 A21 10.00| 1.00 A35 0.20 1.00 10%乙清水 10%乙腈水 9 方法结束 2.样品制备及前处理 2.1提取 准确称取搅碎后的新鲜鱼肉样品5.0g于50mL离心管中，加入2.0 g无水硫酸钠，加入20 mL酸化乙腈进行提取，用AH-30全自动均质器均质1.0min， 3800 rpm离心5.0 min，重复一次。取上清液于250 mL分液漏斗中，加入15 mL 乙腈饱和的 正己烷，振摇20s，静置取下层乙腈溶液。将所得乙腈溶液于 MPE-16 高通量真空平行浓缩仪浓缩至近干，加入10 mL的 Na，EDTA(0.1 mol/L)-McIlvaine(0.1M)缓冲溶液(pH=4.0)，摇匀备用。 2.2固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 Raykol Fotector Plus 固相萃取柱 HLB柱 (RayCure， 500mg/6mL) 活化 甲醇 淋洗 pH 4.0甲酸水溶液 洗脱 甲醇 2.3固相萃取净化 分别以5 mL甲醇和5mL甲酸水溶液(pH4.0)活化 HLB柱(技迩 RayCure HLB， 500mg/6mL)后，将上述样品品液以2 mL/min 的速度进行上样，并用3mL的甲酸水溶液(pH4.0)溶液清洗样品瓶。以20%的甲醇甲酸水溶液溶液(pH4.0)对固相萃取 psi 的氮气流下吹干 HLB柱，最后以10 mL 的甲醇洗脱目标化合物(具体的净化步骤请见图2)。将所得洗脱液在Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪上浓缩至近干，加入10%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)定容至1mL，上机测试。 柱进行淋洗除去残留的无机盐和残留基质。在20 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间 (min) 1 清洗样品通道 CH30H 60 5 1.5 2 活化 CH30H 废液1 5 5 1.4 3 活化 pH4.0 Form... 废液1 4 5 1.7 4 上样 废液1 3 10 4.1 5 清洗样品瓶 pH4.0 Form... 废液1 60 3 1.8 6 淋洗 Methol (20%... 废液1 5 5 1.4 7 气推 废液1 10 10 1.8 8 吹干 10 9 清洗注射泵 CH30H 40 2 |0.4 10 洗脱 CH30H 收集 2 10 5.6 11 气推 收集 10 5 1.1 12 结束 图-2 fotector plus固相萃取净化方法 3.检测条件 3.1色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5um×21 mm×50mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A： 10mM ammonium acetic (0.1% formic acid)， B： Methanol 柱温 35℃ 进样体积 10uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 3500°C 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0-1.0 min， 90%流动相A； 1.0-4.0 min， 50%的流动相A； 4.01-6.0 min，50%流动相A保持2 min；6.01-7.0 min， 90%的流动相A； 7.01-10.0 min， 90%的流动相A保持3 min。 3.2 MRM 参数 表-1.16种沙星类抗生素串联质谱检测参数 3.3色谱图 下图为16种沙星类抗生素的标准品在液质上的色谱图： 图-316种沙星类抗生素的保留时间与色谱图 4.样品测试 4.1基质效应验证 为了消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响，需用空白样品提取液来配制标准工作曲线。如果基质加标浓度准确，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标做工作曲线进行定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，1，各点权重相等，拟合出工作曲线，要求R>0.995；此曲线两周需要重新配置一次。 4.2样品基质加标测试 为了验证该方法的回收率，本实验向鳗鱼样品(5g)中分别加入上述16种抗生素类标准品(20uL，1 mg/L， n=4) 进行加标回收验证。测试结果如表 -2所示，16种抗生素回收率在82-95%之间， RSD值小于15%。说明该方法能够很好地运用于鳗鱼样品中16种沙星类抗生素的检测。 表-2.鳗鱼样品中的加标回收率及 RSD 值(20 ug/kg) 化合物(Compound) 回收率(%)样品-1 Sample-1 回收率(%) 样品-2 Sample-2 回收率(%) 样品-3 Sample-3 回收率(%) 样品-4 Sample-4 平均回收率 Average Recoveries (%) RSD (%) 伊诺沙星 79.19 83.90 87.55 93.05 85.92 6.82 氟罗沙星 81.92 82.88 86.77 92.46 86.01 5.56 诺氟沙星 95.93 83.79 104.05 93.87 94.41 8.83 氧氟沙星 83.78 83.70 90.62 88.27 86.59 3.96 培氟沙星 96.26 88.60 99.10 95.31 94.82 4.69 环丙沙星 86.06 80.45 94.96 90.50 87.99 7.05 洛美沙星 74.20 81.65 77.98 95.38 82.30 11.22 丹诺沙星 84.64 79.41 89.02 85.00 84.52 4.67 恩诺沙星 79.85 82.26 86.53 84.14 83.19 3.41 奥比沙星 92.61 100.04 81.03 96.77 92.61 8.96 沙拉沙星 82.43 89.91 104.67 97.31 93.58 10.22 双氟沙星 78.91 88.30 97.19 89.37 88.44 8.47 司帕沙星 88.20 80.15 86.39 81.70 84.11 4.52 氟甲喹 79.77 88.47 75.89 87.20 82.84 7.26 噁喹酸 78.77 88.47 79.89 87.20 83.59 5.93 萘啶酸 92.26 87.57 82.64 91.29 88.44 4.93 5.结果与讨论 水产品及其制品成分复杂，应采用20%的酸化甲醇进行淋洗，可以有效地除去部分杂质，降低样品分析步骤的基质抑制效应。 回收率稳定。但氮吹时间如果过长，样品浓缩干燥后待测化合物可能以固态颗粒的形式随着氮吹气流飞走而损失。 洗脱液氮吹应至近干，磺胺和沙星类化合物的 6.总结 本解决方案操作方便、提取和浓缩效率高、回收率好。使得整个检测结果更加具有平行性与可靠性。 AH-30全自动均质器可以自动完成16个样品均质，均质后能够自动清洗刀头，清洗刀头时可以采用水洗、超声声和溶剂洗等多级清洗组合； MPE-16高通量真空平行浓缩仪特别试用于大体积提取液的浓缩，浓缩效率是单台旋蒸的16倍。独特的尾管设计方方用户观察剩余体积和定容； FotectorPlus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可 以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行； Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪通过独特的针自动追随液面技术可以极大地减少氮气使用量，同时避免手动氮吹需要经常去调节氮吹针高度带来的麻烦。Auto Prep 200全自动液体样品处理工作站能够实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，极大减轻工作量并且保护实验人员的身体健康；同时仪器程序化运行可以有效避免人为误差，保证曲线的精密性和准确性。 TT 高通量真空平行浓缩 高通量全自动固相萃 全自动液体样品处理工 全自动均质器 仪 取仪 全自动平行浓缩仪浓缩 作站 均质 浓缩 净化 标液制备 Raykol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2020年10月版 邮箱： info@raykol.com热线：址：www.raykol.com 热线：箱： info@raykol.com网址：：Vwww.raykol.com 沙星类（Quinones, QNs）抗生素(图-1)是一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小、价格低廉等特点，被大量用于治疗和预防水生动物疾病及促生长。本方案参考农业部1077号公告-1-2008 《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留的测定 液相色谱-串联质谱法》，采用酸化乙腈对目标化合物进行提取。由于标准中只进行了简单的除脂，提取液中仍含有大量的样品基质，容易干扰后续的液质测试。所以本方案采用HLB柱对提取液进行净化，使得整个检测结果更加具有平行性与可靠性。