水产品中沙星类化合物检测方案(浓缩仪)

智能文字提取功能测试中

自动化样品前处理解决方案-RK-2019-F006 水产品中沙星类化合物的测定解决方案 1.介绍 沙星类(Quinones，QNs)抗生素(图1)是一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小、价格低廉等特点，被大量用于治疗和预防水生动物疾病及促生长。 恩诺沙星 氟罗沙星 诺氟沙星 氧氟沙星 双氟沙星 依诺沙星 奥比沙星 沙拉沙星 司帕沙星 图1.16种沙星类抗生素的结构式 本方案参考农业部1077号公告-1-2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留的测定液相色谱-串联质谱法》，采用酸化乙腈对目标化合物进行提取。由于标准中只进行了简单的除脂，提取液中仍含有大量的样品基质，容易干扰后续的液质测试。所以本方案采用HLB 柱对提取液进行净化，使得整个检测结果更加具有平行性与可靠性。 关键字：全自动固相萃取；均质器；浓缩仪；高效液相色谱-串联质谱；沙星类化合物 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 Raykol AH-30全自动均质器 Raykol MPE 高通量真空平行浓缩仪 Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 Agilent 1260 高效液相色谱(HPLC)， Agilent6410 质谱检测器(MS) HLB固相萃取柱(CNW，500 mg/6mL)甲醇(优级纯)，水 Na2EDTA (0.1 mol/L) -MCIlvaine (0.1M)缓冲溶液(pH4.0)， 准确60.2g乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钠17.8 g和柠檬酸21.0 g与烧杯中，加入1000mL的纯净水，加入浓盐酸调节pH值至4.0。如果该缓冲液在放置过程中易析出晶体，那么请将浓度减半进行配制。 3.标准溶夜的配制 将1000.0 Hg/mL 的单标储备液取出，于室温平衡后用 Auto Prep 200全自动液体样品处理工作站配成浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 Hg/mL的标准工作曲线。 序号 命令 源液位 源液浓度 源液体积(mL 目标位 目标浓度 目标体积(mL 溶剂 洗针溶剂 1 填充管路 3.00 10%乙青水 2 配液 A1-16 1000.00 1.50 A21I 10.00| 1.00 10%乙腈水 10%乙腈水 3 直接稀释 A21 10.00 1.00 A22I 1.00 1.00 10%乙腈水 10%乙腈水 4 直接稀释 A22 1.00 1.00 A31| 0.01 |1.00 10%乙腈水 10%乙腈水 5 直接稀释 A22 1.00 1.00 A32I 0.02 1.00 10%乙腈水 10%乙青水 6 直接稀释 A22 1.00 1.00 A33| 0.05 1.00 10%乙腈水 10%乙青水 7 直接稀释 A21 10.00| 1.00 A34 0.10| 1.00 10%乙腈水 10%乙青水 8 直接稀释 A21 10.00| 1.00 A35| 0.20 1.00 10%乙腈水 10%乙青水 9 方法结束 4.样品前处理 4.1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 固相萃取柱 活化 淋洗 洗脱 4.2提取 准确称取搅碎后的新鲜鱼肉样品5.0g于50mL离心管中，加入2.0g无水硫酸钠，加入20mL酸化乙腈进行提取，用 AH-30 全自动均质器均质1.0min， 3800 rpm 离心5.0 min， 重复一次。取上清液于 250 mL 分液漏斗中，加入15 mL 乙腈饱和的正己烷，振摇20s， 静置取下层乙腈溶液。将所得乙腈溶液于 MPE高通量真空平行浓缩仪浓缩至近干， 加入10 mL的NazEDTA(0.1mol/L)-McIlvaine(0.1M)缓冲溶液(pH=4.0)，摇匀备用。 4.3净化 分别以5mL 甲醇和5mL甲酸水溶液(pH4.0)活化HLB柱 (Oasis 500 mg， 6 mL)后，将上述样品溶液以2 mL/min的速度进行上样，并用3mL的甲酸水溶液(pH4.0)溶液清洗样品瓶。以20%的甲醇甲酸水溶液溶液(pH4.0)对固相萃取柱进行淋洗除去残留的无机盐和残留基质。在 20 psi 的氮气流下吹干HLB柱，最后以10 mL 的甲醇先脱目标化合物(具体的净化步骤请见图2)。将所得洗脱液在 AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪上浓缩至近干，加入10%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)定容至1mL，上机测试。 序号 命令 溶剂 排出 .流速 (mL/min) 时间(min) 1 清洗样品通道 CH30H 60 5 1.5 2 活化 CH30H 废液1 5 5 1.4 3 活化 pH4.0 Form... 废液1 4 5 1.7 4 上样 废液1 3 10 4.1 5 清洗样品瓶 pH4.0 Form... 废液1 60 3 1.8 6 淋洗 Methol (20%... 废液1 5 5 1.4 7 气推 废液1 10 10 1.8 8 吹干 10 9 清洗注射泵 CH30H 40 2 0.4 10 洗脱 CH30H 收集 2 10 5.6 11 气推 收集 10 5 1.1 12 结束 图2.Fotector Plus固相萃取净化方法 5.检测条件 5.1色谱柱条件 柱子 流速 流动相 柱温 进样体积 检测器 离子模式 吹扫气 氮气温度 簇电压 雾化压力 梯度洗脱 Waters XBridge BEH HILIC 2.5um×21 mm×50mm 0.200 mL/min A：10mM ammonium acetic (0.1% formic acid)， B： Methanol 35℃ 10uL Agilent 6410 ESI 11L/min 350℃ 4000 35 psi 0.0-1.0 min， 90%流动相A； 1.0-4.0 min， 50%的流动相A； 4.01-6.0 min， 50%流动相A保持 2 min； 6.01-7.0 min， 90%的流动相A； 7.01-10.0 min， 90%的流动相A保持3 min。 5.2 MRM参数 表1.16种沙星类抗生素串联质谱检测参数 Compound Precursor Product Ion Dwell Fragmentor Collision Cell Accelerator Name Ion Energy Voltage 321.2 303.2 20 125 20 7 依诺沙星 232.1 20 125 36 7 370.0 370.0 20 135 13 7 氟罗沙星 326.2 20 135 25 7 诺氟沙星 320.2 302.2 20 130 18 7 233.1 20 130 22 7 氧氟沙星 362.2 318.2 20 140 16 7 261.1 20 140 26 7 培氟沙星 334.2 316.2 20 145 18 7 290.3 20 145 14 7 环丙沙星 332.2 314.2 20 18 7 231.1 20 40 7 洛美沙星 352.3 308.2 20 14 7 265.1 20 22 7 丹诺沙星 358.2 340.2 20 135 20 7 255.1 20 135 42 7 恩诺沙星 360.2 342.2 20 135 20 7 316.2 20 135 16 7 奥比沙星 396.4 396 20 135 21 7 295.1 20 135 37 7 沙拉沙星 386.2 342.2 20 18 7 299.2 20 30 7 双氟沙星 400.2 356.3 20 18 7 299.1 20 135 30 7 司帕沙星 393.3 349.3 20 18 7 292.2 20 26 7 氟甲喹 262.1 262.1 20 13 7 244.1 20 105 33 7 噁喹酸 262.2 262 20 100 13 7 244 20 100 29 萘啶酸 233.2 233 20 90 9 7 215.1 20 90 25 7 5.3 MRM色谱图 图3.16种沙星类抗生素的保留时间与色谱图 6.样品测试 6.1基质效应验证 为了消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响，需用空白样品提取液来配制标准工作曲线。如果基质加标浓度准确，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标做工作曲线进行定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重 相等，拟合出工作曲线，要求R>0.995；此曲线两周需要重新配置一次。 6.2样品基质加标测试 为了验证该方法的回收率，本实验向鳗鱼样品(5g)中分别加入上述16种抗生素类标准品(20uL， 1 mg/L， n=4) 进行加标回收验证。测试结果(如表2)所示，16种抗生素回收率在82-95%之间，RSD 值小于 15%。说明该方法能够很好地运用于水产品中16种沙星类抗生素的检测。 表2.鳗鱼样品中的加标回收率及 RSD 值(20 ug/kg) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 RSD (%) (Compound) 样品-1 样品-2 样品-3 样品-4 Average Sample-1 Sample-2 Sample-3 Sample-4 Recoveries (%) 伊诺沙星 79.19 83.90 87.55 93.05 85.92 6.82 氟罗沙星 81.92 82.88 86.77 92.46 86.01 5.56 诺氟沙星 95.93 83.79 104.05 93.87 94.41 8.83 氧氟沙星 83.78 83.70 90.62 88.27 86.59 3.96 培氟沙星 96.26 88.60 99.10 95.31 94.82 4.69 环丙沙星 86.06 80.45 94.96 90.50 87.99 7.05 洛美沙星 74.20 81.65 77.98 95.38 82.30 11.22 丹诺沙星 84.64 79.41 89.02 85.00 84.52 4.67 恩诺沙星 79.85 82.26 86.53 84.14 83.19 3.41 奥比沙星 92.61 100.04 81.03 96.77 92.61 8.96 沙拉沙星 82.43 89.91 104.67 97.31 93.58 10.22 双氟沙星 78.91 88.30 97.19 89.37 88.44 8.47 司帕沙星 88.20 80.15 86.39 81.70 84.11 4.52 氟甲喹 79.77 88.47 75.89 87.20 82.84 7.26 噁喹酸 78.77 88.47 79.89 87.20 83.59 5.93 萘啶酸 92.26 87.57 82.64 91.29 88.44 4.93 7.结果与结论 6.1水产品及其制品成分复杂，应采用20%的酸化甲醇进行淋洗，可以有效地除去部分杂质，降低样品分析步骤的基质抑制效应。 6.2洗脱液氮吹应至近干，磺胺和沙星类化合物的回收率稳定。但氮吹时间如果过长，样品浓缩干燥，则待测化合物可能以固态颗粒的形式随着氮吹气流飞走而损失。 8.解决方案的优势 睿科 AH-30全自动均质器实现多任务的高通量均质，完全取代了手动均质的过程。一次最多处理32个样品，大大提高工作效率。 睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作 站能够实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，极大减轻工作量并且保护实验人员的身体健康；同时仪器程序化运行可以有效避免人为误差，保证曲线的精密性和准确性。 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 MPE 真空平行浓缩仪/AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪，大大地提高了样品前处理效率，真正完全解放实验室人员劳动。 邮箱：info@raykol.com热线：址：www.raykol.com 沙星类（Quinones，QNs）抗生素是一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小、价格低廉等特点，被大量用于治疗和预防水生动物疾病及促生长。本方案参考农业部1077号公告-1-2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留的测定 液相色谱-串联质谱法》，采用酸化乙腈对目标化合物进行提取。由于标准中只进行了简单的除脂，提取液中仍含有大量的样品基质，容易干扰后续的液质测试。所以本方案采用HLB柱对提取液进行净化，使得整个检测结果更加具有平行性与可靠性。