细菌中生物被膜检测方案(细胞定量分析)

智能文字提取功能测试中

利用细胞阻抗技术研究细菌生物被膜 Maria D. Ferrer，Brandon Lamarche，Alex Mira' 公共卫生署高级研究院 本应用简报介绍如何使用 Agilent xCELLigence 实时细胞分析 (RTCA)仪器进行阻抗检测。xCELLigence 克服了传统比色法的局限，提供了一种无标记且完全自动化的方法，可用于定量和连续评估生物被膜。 FISABIO 基金会中心 西班牙瓦伦西亚 ( 2 ： 安捷伦科技公司 ) 美国加利福尼亚州圣地亚哥 除了在水环境中以自由浮动的浮游生物状态生活外，细菌还可以在液-固和气-固界面定殖于生物和非生物表面。在这些微环境中，分泌的化学信号因子用于协调整个菌落的基因表达谱，从而促进生存1.2。这些群落可能由数百种不同的细菌组成，其常见的适应方式是分泌由多糖、核酸、脂类、磷壁酸或蛋白质组成的胞外聚合物(EPS)。EPS 基质可包裹细菌并保护其免受环境的危害(图1)。形成这些生物被膜的能力是一种关键的毒力因子，因为 EPS 基质有助于细菌逃逸宿主免疫反应，还可以使细菌的抗生素抗性提高多达1000倍。 除了在人牙菌斑和龋齿、慢性感染、对人工植入体的聚合物基质的排异反应，以及食物中毒等方面发挥关键作用外，细菌生物被膜还导致了大部分的牲畜疾病，并造成工业空气和水处理系统的污染。开发治疗或预防生物被膜的药物至关重要。但是传统上用于研究生物被膜的比色法效率或通量较低，与正交分析不兼容(样品在分析过程中被破坏)，且仅能提供终点数据。 图1.细菌生物被膜示例。金黄色葡萄球菌细胞(球体)包裹在其分泌的聚合物基质中的电镜图 xCELLigence RTCA 阻抗分析的功能单元是一组嵌合在微孔板底部的微金电极生物传感器(图2)。当加入导电溶液(例如缓冲液或生长培养基)中时，在这些生物传感器上施加弱电压会使电流在它们之间流动。由于这种现象依赖于生物传感器与整体溶液的相互作用，因此在生物传感器-溶液界面处贴壁细胞的存在会阻碍电流流动。阻抗的大小取决于细胞数量、细胞大小以及细胞-底物粘附强度。研究表明，细胞健康状况和行为不受微金电极生物传感器表面或电势(仅22mV，仅以用户自定义的频率间歇施加)的影响。 (玻璃或 PET) 图2.细胞阻抗分析原理概览。(A)在加入细胞前后，安捷伦电子微孔板 (E-Plate) 中单孔的侧视图。微金电极生物传感器和细胞均未按比例绘制(为了清楚起见，对它们进行了放大处理)。在没有细胞的情况下，电流自由地通过培养基，形成了微金电极生物传感器之间的电回路。由于细胞在生物传感器上粘附并增殖，电流的流动受到阻碍，从而提供了细胞数量、细胞大小、细胞-底物粘附强度的高灵敏度读数。(B) E-Plate 单孔的俯视照片。注意，与图A中的简化示意图相比，生物传感器实际上是一个交错阵列，覆盖了超过75%的孔底面积。尽管可以直接在微金电极生物传感器表面观察到细胞，但孔中间包含无生物传感器分布区域的特殊 E-Plate(此处未显示)更有利于显微镜成像。 xCELLigence RTCA 被广泛用于真核细胞的研究，其应用范围包括 GPCR激动/拮抗和肿瘤药物发现，以及免疫疗法效价分析和毒理学。然而，在此之前，RTCA很少用于原核生物的研究，在过去几年中仅发表了数篇论文3.4。这些粗略的研究表明，不同菌株的金黄色葡萄球菌在Agilent E-Plate 上的生长确实会导致阻抗信号随时间增强。其动力学信息与正交分析中观察到的结果一致。我们认为，阻抗检测非常适用于基础和应用生物被膜研究，因此通过优化分析条件，并探索生物被膜影响阻抗信号方式之间的细微差别进行了更深入的研究。我们希望解答的两个 关键问题是： 细菌及其分泌的 EPS 是否都能影响阻抗信号? 是否可以利用阻抗检测定量药物防止生物被膜形成或导致已建立生物被膜破坏的有效性? 这些研究的结果已经发表5，并作为正在进行的细菌生物被膜研究的基础。通过介绍具体的案例研究，我们旨在对使用xCELLigence RTCA 探索生物被膜生物学和抗生物被膜药物筛查的不同方面的优化方法进行概括总结。 细菌种类和培养条件 我们已经使用XCELLigence RTCA 对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌进行了成功的分析。所分析具体菌株的完整列表参见 Ferrer； et al.。从-80℃存储环境中取出细菌，将其培养于胰蛋白酶大豆琼脂板上。在37℃条件下培养24-48 小时后，将单个菌落接种于胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基。在37℃下振荡过夜后，使用含 0.25%(w/v)葡萄糖 (TSBG)的TSB将培养基稀释至 OD650=0.175。如后续章节所述，将这些稀释的储备液用于接妾 E-Plate 96。 仪器准备和测量背景阻抗 使用xCELLigence RTCA MP(多板)仪器进行实验，该仪器置于维持37°C温度设定的标准培养箱中。也可以将XCELLigence 仪器置于低氧室或不同的大气成分 (CO，及其他气体)中。在 E-Plate96的每个孔中加入100 pL TSBG后，将板放入 xCELLigence 仪器，并使用 RTCA软件记录背景阻抗(即不存在细胞时生长培养基的固有电阻)。 E-Plate 接种、数据采集和数据制图在常规实验中，将100 uL稀释后的葡萄球菌培养基添加到含有100uL用于背景测量的 TSBG 孔中(最终体本为200uL/孔)。设置3个生物学重复样品或技术重复样品。将 E-Plate 96 放回 XCELLigence 仪器后，对 RTCA 软件进行编辑，使其每15分钟记录一次阻抗测量值，持续记录24小时。使用无单位参数细胞指数绘制阻抗值，该参数被定义为(Z，-Z)/15，其中Z和Z乙分别为存在和不存在细胞时的阻抗值。通常将数据绘制为平均细胞指数±标准偏差。 评估蛋白类生物被膜对阻抗信号的影响细菌生物被膜产生的阻抗信号可能是细胞和EPS共同作用的结果。EPS的分子组成，以及组成分子的相对比例，在不同的细菌种类之间存在差异。为评估富含蛋白质的基质对阻抗的影响，在接种时向含有金黄色葡萄球菌V329 的 E-Plate 孔添加蛋白酶K(最终浓度为100 pg/mL)。这种酶不会影响葡萄球菌细胞壁的完整性，但能部分降解细胞外蛋白类基质。 鉴定防止生物被膜形成的药物 对抗生物被膜的一种关键方法是防止它们的形成。我们评估了不同的相关抗生素抑制 E-Plate 内生物被膜形成的能力。在E-Plate 96 的每个孔中加入含有不同抗生素(浓度范围为62.5 ng/mL-32 pg/mL)的 TSBG (100pL)， 并测量背景阻抗。 将稀释后的金黄色葡萄球菌240培养基(如上所述)加入每个孔中，通过每15分钟记录一次阻抗值，持续记录24小时，检测生物被膜的形成。通过对每种药物浓度和细胞接种20小时后的细胞指数百分比进行制图，分析每种药物的预防性疗效。CI 百分比定义为：%细胞指数=(CI用药/CI未用药)×100。将抑制生物被膜形成的最低抗生素浓度(产生小于0.05的CI值)定义为生物被膜最小抑菌浓度(Bio-MIC)。 鉴定破坏已建立生物被膜的药物 除了抑制生物被膜的出现/形成外，还需要能够破坏已建立生物被膜的试剂。为了解 XCELLigence RTCA 是否可用于筛查具有这种生物被膜破坏活性的药物，首先在E-Plate 中培养表皮葡萄球菌43040生物被膜，直到达到其指数生长期；然后加入抗生素。具体而言，使用100 pLTSBG 培养基进行背景测量，然后在每孔中加入含过夜培养基的 75 pL TSBG， 得到最终OD650=0.0875。每15分钟记录一次阻抗，持续记录9小时，使培养物达到具有稳定阻抗信号的对数生长中期。然后，从仪器中取出 E-Plate，并向每个 孔中添加25uL抗生素溶液(浓度范围为62.5 ng/mL-32 pg/mL)。将板放回仪器后，每15分钟记录一次阻抗，持续记录25小时。 信号幅度和重复性 与先前的出版物报道一致，观察到的表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌阻抗信号始终是真核细胞通常观察到的信号的1/10 左右。这可能由以下原因造成： 细菌较小，因此提供了更薄的绝缘层，该绝缘层阻止电流流动的能力较弱 与真核细胞相比，细菌的排列均匀性和密集性较差(从而为电极间的电流流动提供了更多通道) 以上两种原因结合 尽管信号较弱，但七个技术重现样品之间的标准偏差表明数据的重复性可接受(图3A)。 细菌和 EPS均与阻抗信号相关 为评估 EPS 对阻抗信号的影响方式，将表皮葡萄球菌的生物被膜产生型 (CH845)菌株和非生物被膜产生型(CECT 231)菌株进行并列培养。从图3B可以看出，生物被膜产生型菌株表现出更强的阻抗信号。为了确认这种差异由是否存在 EPS 引起，将 CH845 与同基因型突变体进行了共同培养。该突变体缺乏调节生物被膜的蛋白质和多糖成分产生的 sarA 基因。当在液体 培养基中通过光密度测量进行评估时，与WT(数据未显示)相比，该突变并未造成生长速率的显著差异。△sarA 突变体显示阻抗信号降低，这一事实表明， EPS确实直接或间接地影响了 xCELLigence RTCA测量的阻抗信号(图3C)。金黄色葡萄球菌的V329 和V329 AsarA 菌株也得到了类似的结果(数据未显示)。评估 EPS 对xCELLigence RTCA 阻抗信号影响的另一种手段是在含有或不含蛋白酶K的培养基中培养蛋白类生物被膜产生型金黄色葡萄球菌V329。虽然蛋白酶K的存在不影响浮游生物分析中细菌的生长速率(数据未显示)，但是却降低了 V329 的阻抗信号(图3D)。 尽管这些实验共同证明了 EPS 对阻抗信号的影响，但它们并不能解释出现这种情况的原因。一种可能是 EPS 成分阻碍了电流的流动。或者，观察到的 EPS的影响可能仅仅是细胞外基质将更多细菌粘附于板底，或将细菌更紧密地粘附于电极上的结果。为了研究这些可能性，利用阻抗、细胞计数和多糖定量三种平行分析对胞外多糖生物被膜产生型金黄色葡萄球菌 Isp479c 的生长情况进行了检测(图3E). 虽然细胞数量在6小时达到峰值，并保持恒定至12小时，但在此时间范围内，阻抗信号和总多糖含量显著增加。这清楚地表明， xCELLigence 分析法不仅仅能够检测生物被膜中存在的细胞数量，还能够检测其他参数。 A 金黄色葡萄球菌 D 蛋白类生物被膜产生型金黄色葡萄球菌 V329 E 胞外多糖生物被膜产生型金黄色葡萄球菌 Isp479c B 表皮葡萄球菌菌株的比较 C 同基因型表皮葡萄球菌菌株的比较 图3.评估生物被膜信号的重复性，以及 EPS 对阻抗信号的影响。(A)通过检测7个金黄色葡萄球菌重复样品评估生物被膜来源阻抗信号的实验内变异。此处绘制了平均值和置信区间。相对于平均值的平均标准偏差为12%。(B)产生 (CH845) 或不产生 (CECT231) EPS 的表皮葡萄球菌菌株的比较。(C)表皮葡萄球菌的生物被膜产生型 CH845 菌株与 EPS 产生缺陷的同基因型 AsarA 突变体的比较。(D)在存在或不存在蛋白酶K的情况下，检测金黄色葡萄球菌 V329菌株的蛋白类生物被膜形成。虽然培养基中蛋白酶K的加入不会减少存在的细菌数量(数据未显示)，但是却会降低与V329生长相关的阻抗信号。(E)胞外多糖生物被膜产生型金黄色葡萄球菌 Isp479c 生长过程中阻抗信号、总细胞数和多糖含量的并列比较 实验室正在研究 EPS成分是否直接阻碍电流流动，或 EPS 是否导致细菌与 E-Plate生物传感器更密切的相互作用。 总体而言，结果与细胞和生物被膜的EPS均与 xCELLigence 仪器检测的阻抗信号有关的理论模型一致。这是一个有价值的发现，因为它表明此类问题可以使用实时细胞分析进行检测。 生物被膜阻断剂的筛查 当金黄色葡萄球菌240 接种至 E-Plate 孔中时，通过在生长培养基中加入抗生素，评估了 RTCA 识别生物被膜阻断活性的能力。如图4A所示，测试的10种抗生素均表现出预防活性，但是有效性却各不相同。头孢噻肟在 0.25 ug/mL 的浓度下完全破坏了与生物被膜相关的信号，而利奈唑胺则需要高128倍的浓度才能达到这一效果。作为上述原理的证明，该实验表明RTCA 可用作防止生物被膜形成药物的筛查工具。 与此高度相关的发现是，在特定的浓度范围内，一些抗生素实际上可以促进生物被膜的生长。能够表征这种不良作用，对于防止医生无意间加剧他们正在努力治疗的感染至关重要。使用 RTCA 可以轻松检测并定量这种差异性行为。当浓度为4-32 ug/mL时，万古霉素抑制表皮葡萄球菌43040 生物被膜的生长；然而，当浓度为62.5 ng/mL-2pg/mL时，则会刺激生物被膜的生长(图4B)。 A 不同抗生素处理后的金黄色葡萄球菌 B 预防：万古霉素处理后的表皮葡萄球菌 C 破坏：氯唑西林处理后的表皮葡萄球菌 (一m--))未处理对照 (-+-)32 pg/mL (一16 pg/mL (--)8 pg/mL ()4 pg/mL (--)2pg/mL -) 1 pg/mL (-)0.5 pg/mL (--)00.25 pg/mL (-0)0.13pg/mL (---) 0.063 pg/mL 图4.使用 RTCA 筛查可以防止生物被膜形成或破坏已建立生物被膜的药物。(A)对10种不同的抗生素(每一种用不同颜色的线表示)防止金黄色葡萄球菌240形成生物被膜的能力进行了评估。从细菌接种至孔中的那一刻起，抗生素就以不同的浓度存在。在接种后20小时，测量CI 并与未处理的对照进行比较。此处绘制的%CI可简单表示为[(细胞指数)用药/(细胞指数)未用药]×100。(B)预防活性测试。万古霉素对表皮葡萄球菌43040生物被膜生长的抑制作用或刺激作用取用于其浓度。(C)破坏活性测试。当浓度高于 0.13 ug/mL时，只有氯唑西林和利福平能够引起表皮葡萄球菌生物被膜的部分破坏 生物被膜破坏剂的筛查 通过建立表皮葡萄球菌 43040的生物被膜，然后使用抗生素对其进行处理，探测对生物被膜的破坏活性。从图4C可以看出，在浓度为0.125-8 pg/mL时，氯唑西林和利福平能够引起生物被膜的部分破坏，在最极端的情况下，CI下降约60%。测试的10种抗生素均不能完全破坏生物被膜： 与已知生物被膜的抗生素抗性一致 证明测试药物对生物被膜(而非浮游菌体)状态抑制的有效性非常重要，以及 表明需要更强力有效的药物 我们证明了 xCELLigence RTCA 可用于生物被膜研究中的一些基础和复杂应用。与传统的分析方法相比，该方法所涉及的工作量明显较少：仅需将细菌接种至E-Plate中，然后连续自动地进行数据采集即可。xCELLigence 数据的实时性可实现不同菌株和处理之间的定量比较，并可 www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( @安捷伦科技(中国)有限公司，2019 ) 2019年11月1日， 中国出版5994-1065ZHCNAN 17DE.5684143518 评估细菌及其EPS。利用传统的终点分析法获得详细的生物被膜动力学信息需要耗费大量的工作时间，且无法实现相同水平的重复性。本应用简报中概述的优势在6篇已发表的(由独立的团队发表)xCELLigence 生物被膜论文15-101中进行了重点介绍。 ( 1. 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Monitoring in Real Time the Formation andRemoval of Biofilms from Clinical Related Pathogens Using anImpedance-Based Technology. PLoS One. 2016 Oct 3，11(10)，e0163966 ) ( 7. Wang， T.； Su， J. Bacillus subtilis from Soybean Food Shows Antimicrobial Activity for Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii by Affecting the adeS Gene. J.Microbiol. Biotechnol.2016 Dec 28， 2 6 (12)， 2043-2050 ) ( 8. van Duuren，J. B . J. H.； et al. Useof Single-Frequency ImpedanceSpectroscopy to Characterizethe Growth Dynamics of Biofilm Formation in Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 2017 Jul 1 2， 7(1)，5223 ) ( 9. Gutierrez， D.；et al. Real-TimeAssessment of Staphylococcusaureus Biofilm Disruption by Phage-Derived Proteins. Front Microbiol. 2017 Aug 2 4， 8， 1632 ) ( 10. M uras， A . ； et al. Inhibition ofSteptococcus Mutans BiofilmFormation by Extracts of T enacibaculum s p . 20J， a Bacterium with Wide-Spectrum Quorum Quenching Activity. J. 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