枸杞中枸杞多糖的单糖组成检测方案(离子色谱仪)

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2 3Thermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.SCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific 李静李仁勇韩春霞王海波郑洪国 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：毛细管离子色谱；脉冲安培检测； Capillary CarboPac PA20； 单糖组成；枸杞多糖 Key words： Capillary lon Chromatography； PAD； Capillary CarboPacPA20； Monosaccharide Constituents； Lycium Barbarum Polysaccharide； 引言 枸杞是我国一种传统中药材，枸杞多糖是其主要功能活性成分，具有抗癌、增强免疫力、降血糖、防衰老、抑制肿瘤生长和细胞突变等功效1.21。近几年来随着对枸杞多糖的研究不断深入，发现其具有良好的研究和应用前景。而能准确测定枸杞多糖中单糖的组成则对研究其化学结构和性质具有重要意义。 毛细管离子色谱分离-脉冲安培检测( Capillary IC-PAD ) 无需衍生即可分离测定样品中的糖类化合物，分离度好，检测灵敏度高高，并且具有高效率、高重现性、低消耗、环保等优势。本实验采用新型淋洗液自动发生装置产生淋洗液， Capillary CarborPac PA20色谱柱分离，毛细管安培池检测，成功对枸杞多糖中单糖组成进行了测定。 测试条件 仪器：ICS-5000型离子色谱仪毛细管系统( Dionex， 美国)； Au工作电极， Ti对电极， Pd/H参比电极， Chromeleon 6.80 色谱工作站，AS自动进样器； 分析柱： Capillary CarboPac PA20， 0.4mmx150mm； 保护柱： Capillary CarboPac PA20G， 0.4mm×35mm； 柱温：30℃；流速：8uL/min；定量环：0.4uL； 淋洗液：毛细管淋洗液自动发生装置Capillary EGC-KOH Cartridge产生KOH； 条件(1)0-15 min 8mmol/L， 15.1-23 min 200 mmol/L，23.1-28min 8mmol/L； 条件(2)0-20 min 3mmol/L， 20.1-28min 200mmol/L， 28.1-33min 3mmol/L； 检测方式：脉冲安培检测，Au工作电极， Pd/H参比电极模式，糖四电位波形，电位波形见下表。 表1.糖测定的四电位波形 时间(s) 电位 (V) 积分 0.000 0.950 0.200 0.950 On 0.400 0.950 Off 0.410 -1.150 0.420 -1.150 0.430 1.450 0.440 0.750 0.500 0.750 样品前处理 精确称取0.5g枸杞多糖于50mL超纯水中，振荡使之充分溶解。在水解管中分别加入上述1mL枸杞多糖溶液和4mol/L的三氟乙酸溶液1mL，摇匀后在100℃下恒温水解120分钟，氮气吹干后加5mL水溶解。取上述溶解液0.5mL稀释至10mL，稀释液分别过0.22um尼龙滤膜和OnGuard RP前处理柱，弃去前面3mL流出液，收集后面溶液进样。 结果和讨论 色谱柱的选择及淋洗液梯度条件优化 Capillary CarboPac PA20毛细管色谱柱延续了CarboPac PA型色谱柱的特点，填料采用无孔基球附聚双官能季铵功能基。该色谱柱对单糖分离度高，峰型好，因而灵敏度高，分离速度快。枸杞多糖水解液中含有多种待测单糖组分，本文中使用两种色谱淋洗条件，对水解液10种单糖进行了定性和定量分析。 其中条件1用于测定岩藻糖(Fuc)，鼠李糖(Rha)，阿拉伯糖(Ara)，氨基葡萄糖(GlcN)，半乳糖(Gal)，葡萄糖(Glc)，以上六种单糖所有实验数据均采用淋洗液条件1获得。条件2用于测定木糖(Xyl)，甘露糖(Man)，果糖(Fru)，核糖(Rib)，以上四种单糖所有实验数据均采用淋洗液条件2获得。两种淋洗条件下样品分离色谱图见图1和图2。 图1.淋洗条件1样品分离色谱图 图2.淋洗条件2样品分离色谱图 使用阴离子交换色谱柱分离单糖，淋洗液中OH有两种作用，首先是作为淋洗离子， OH 浓度增大，淋洗强度增大，使单糖在色谱柱上保留减弱。同时OH提供糖解离所需的高pH值环境，常见单糖的pKa基本在12~14之间，当糖还未完全解离为离子时，单糖的离子化程度随pH增加而增大，其在色谱柱上保留能力也会随之增强。单糖的保留行为是上述两种作用共同影响的结果A。 鼠李糖和阿拉伯糖在不同浓度淋洗液中的分离情况既是上述共同作用的体现。25℃时阿拉伯糖pKa为12.43， L型鼠李糖的pKa为12.04，二者差异相对较大。当淋洗液液度低于10mmol/L时其pH值低于12，两种单糖都处于不完全电离状态，其中阿拉伯糖的电离度低于鼠李糖。两种单糖在低浓度淋洗液中保留时间基本相同，而当淋洗液浓度升高时，两种单糖的保留时间虽然都在减小，但因为两糖间较大的pKa差距而产生的色谱保留时间的差别也随之逐渐增大，因此二者分离度增加。实验中发现，在2-10mmol/L的范围内，鼠李糖和阿拉伯糖的分离度随淋洗液浓度升高而不断增大，在8mmol/L时即可实现基线分离。淋洗液浓度的增大，会使得其余单糖的分离度受到影响，因此选择8mmol/L为淋洗条件 1。在8mmol/L淋洗时，甘露糖和木糖分离效果较差，甘露糖和木糖的pKa值相近，因此OH的淋洗强度对于分离效果的影响更占主导，淋洗液浓度越低时，单糖与离子交换基团相互作用时间长，从而获得更大分离度。实验数据显示，淋洗液浓度为3mmol/L时，可以实现木糖与甘露糖的有效分离，在实际样品中存在的其它干扰峰也能与待测单糖较好分离，选择3mmol/L为淋洗条件2。两种淋洗条件分离完成后都使用200mmol/LKOH冲洗8分钟，以保证测定的长期稳定性。 多糖的水解效果与所使用酸的种类和浓度、水解温度和水解时间有关，本文分别对以上几种因素进行研究，得出了优化的枸杞多糖水解条件。 文献报道多糖水解常可使用硫酸、盐酸和三氟乙酸(TFA)同，其中三氟乙酸具有更易挥发的特性易通过氮吹等手段去除，并且其酸性相对较弱，水解过程中单糖降解的副反应小，因此使用较为广泛。方法使用三氟乙酸水解多糖后通过氮吹除酸，再以水溶解水解产物，所得溶液组成简单，容易控制稀释倍数，操作过程简单易行。 在反应温度和时间相同并适中的条件下，分别考察三氟乙酸浓度为1 mol/L， 2mol/L， 4mol/L时的水解效果，大部分单糖在TFA为2mol/L时达到最高水解浓度。酸度继续增大则存在单糖分解，浓度会有所降低，因此选择2mol/L三氟乙酸溶液进行水解。 使用2mol/L三氟乙酸水解，在相同水解时间下考察80、90、100、110、120℃时枸杞多糖的水解效果，结果见图3，大部分单糖浓度随水解温度增加而增大，而果糖的浓度呈现急剧下降的趋势，说明果糖的稳定性与温度关系很大，高温会导致果糖的分解或转化。考虑到待测单糖的整体水解效果，选择水解温度为100℃。 在2 mol/L三氟乙酸，水解温度100℃条件下，考察水解时间30、60、90、120、150、210min条件下的水解效果，测定结果见图4，大部分单糖尤其是半乳糖在水解时间为120min时，浓度可达到或接近最大值，而果糖的浓度随时间增加而减小。考虑所有单糖的综合水解效果，最终选择水解时间为120min。此时获得果糖浓度约为水解30min时浓度的50%。 图3.温度对水解效果的影响 图4.时间对水解效果的影响 线性、检出限和定量限 以峰面积进行定量，在0.02-10mg·L'浓度范围内配制标准溶液，10种单糖具有很好的线性，线性相关系数在0.999以上。以信噪比3：1为检测限计算10种单糖的最小检出限，结果列于表2。 实际样品分析 按照样品前处理中方法制备样品溶液，测定枸杞多糖中单糖含量，并以半乳糖摩尔数为基准，计算各种单糖与半乳糖的摩尔数之比，结果见表3。 采用高灵敏度的毛细管离子色谱-脉冲安培检测方法，除可检测常见的几种单糖组分外，还可以实现岩藻糖、氨基葡萄糖、核糖这三种低浓度单糖与其它单糖组分的良好分离和准确定量，具有更高的糖组分识别能力。在色谱图中还分离出多个未知色谱峰，有待进一步研究。枸杞多糖水解液中果糖的浓度与前处理方法有关，下表中果糖的测得数据也存在降解因素的影响，仅起到参考作用。 另取枸杞多糖加入三种浓度的单糖混合标准溶液，按相同的方法制备加标样品溶液并测定，除果糖外加标回收率范围在84%-104%。而果糖加标回收率在50%左右，此现象与优化水解条件时出现的结果基本一致。 结论 本文使用毛细管离子色谱-安培检测研究了枸杞多糖的单糖组成，对其中几种低含量单糖的浓度也可进行准确测定。对水解使用酸种类和浓度、水解温度和时间等前处理条件进行了考察优化，并结合离子色谱糖分析柱对单糖的良好分离能力和脉冲安培检测的高灵敏度，可以对枸杞多糖中单糖组分进行更全面的剖析。本文采用的测定方法也可以广泛用于其他物质中多糖的检测，为多糖结构研究提供更全面有效的信息。 ( [1] 王战勇，闫松，商丽颖等.枸杞多糖的提取纯化 及组成分析.氨基酸和生物资源，2008，30(1)： 22~24 ) ( [2] 朱彩平，张民，张声华.枸杞多糖的组成及结构分 析. 中 草药，2006，37(6)： 872~874 ) ( [3] 李国强，尹平河，赵玲等.离子色谱-积分脉冲安培检测法测定大蒜多糖的单糖组成.分析测试学报， 2007，26(3)：401~403 ) ( [4] 牟世芬，刘克纳，丁晓静.离子色谱方法及应用， 2005 ) ( [5] 陶乐平，丁在富，张部昌.气相色谱在多糖结构测 定中的应用.色谱，1994，12(5)：351~354 ) 表2.10种单糖检出限(mg/L) 岩藻糖 鼠李糖 阿拉伯糖 氨基葡萄糖 半乳糖 葡萄糖 木糖 甘露糖 果糖 核糖 0.0025 0.0039 0.0052 0.0030 0.0063 0.0069 0.0153 0.0306 0.0750 0.0189 表3.枸杞多糖的单糖检测结果 溶液夜度(mg/L) 样品含量(mg/g) 摩尔比(%) 岩藻糖 Fuc 0.026 0.26 0.02 鼠李糖 Rha 0.152 1.52 0.10 阿拉伯糖 Ara 3.184 31.8 2.36 氨基葡萄糖 GlcN 0.076 0.76 0.05 半乳糖 Gal 1.616 16.16 1.00 葡萄糖 Glc 10.242 102.4 6.34 木糖Xyl 0.354 3.54 0.26 甘露糖Man 0.399 3.99 0.25 果糖 Fru 4.004 40.0 2.48 核糖 Rib 0.038 0.38 0.03 thermoscientific.com C 2012 Thermo Fisher Scientific Inc. 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