中药材、中成药、饮片、药物制剂中真菌毒素检测方案(均质器)

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中药材霉变现象iDetelogy 2020中国药典2351真菌毒素测定法mtiDetelogy Detelogy 得泰仪器-药典方案 2351真菌毒素测定法-前处理流程 www.detelogy.com 中药材生产、储存、运输、流通过程中，若管理不当，在外界条件(温度、湿度、车间环境、虫害等)和药材自身因素(含水量>15%、含糖量高等)的综合作用下，易出现霉变现象。 真菌滋生对中药材进行分解和消耗，药材中所含的糖类和脂类物质渗出，从而导致粘连、泛油、异味、变色等现象，其有效药用成分含量降低。 轻度霉变的药材经二次加工处理后即使能入药，也会造成气味变淡、色泽转暗、品质降低、影响疗效的后果。 镰刀菌 青霉菌 H3C OH OCH. OCH. HO HO 黄曲霉素B 黄曲霉素B， 赭曲霉毒素 呕吐霉素 OH OH HO. NH， OH 展青霉素 OH OH HC. .OH OH CH HO. HC CH 0 CH， HC T-2毒素 伏马毒素 MoreIntelligent，MoreEfficient 监控品种 危害简述 黄曲霉毒素AFT(B、B2、B2a、G、G2、G2aM、M2、P) 被世界卫生组织 (WHO) 癌研研究机构划定为一类天然存在的致癌物。其中B，毒性最大，可引起细胞错误地修复DNA，导致严重的DNA诱变，还可抑制DNA和RNA合成，从而抑制蛋白质合成，强致癌性，对肝脏毒性强，毒性比氰化钾要强10倍。 赭曲霉毒素OT(OTA、OTB、OTC) 对肾脏和肝毒性强、致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用 毒性强度OTA>OTC>OTB 伏马毒素FB (B、B2) 对人体和动物的神经系统、肾脏和肝脏功能损害性强，食道癌发病率与伏马毒素污染呈正相关。 玉米赤霉烯酮F-2 有雌激素作用，其强度为雌激素的十分之一，急性中毒时造成神经系统的亢奋和诱发出血，对心脏、肾脏、肝、肺、神经系统、生殖系统具有毒性。 呕吐毒素DON (又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇) 引起人和动物呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、神经紊乱、流产、死胎等，猪是对呕吐毒素最敏感的动物，家禽次之，反刍动物由于瘤胃微生物的作用，耐受力最强。根据人中毒时的症状，俗称“醉谷病" 展青霉素Patulin 神经毒素，致畸性，损害呼吸和泌尿等系统、可改变细胞膜透过性，使膜的物质移动发生异常，从而间接引起生理呼吸异常。 T-2毒素TS 主要作用于细胞分裂旺盛的组织器官，如胸腺、骨髓、肝、脾、淋巴结、生殖腺及胃肠粘膜等，抑制组织细胞蛋白质和DNA合成。抑制细胞中线粒体呼吸作用。 由于各类真菌毒素毒理不同，容易受污染药材品种也不同。 处方中含有易污染的药材以及生粉料的中成药品种应注意相关真菌毒素的检测。 黄曲霉毒素检测：粮谷类、种子类、油性成分多的药材品种 赭曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮： 与粮谷类基质类似的药材，如淡豆豉、薏苡仁、白扁豆等 展青霉素：酸性果实类药材，如枸杞子、乌梅、酸枣仁等 >薄层色谱法(TLC)-用于初筛，灵敏度差 将适宜固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值(Rf) 与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(Rf)作对比。 >胶体金免疫层析法 (DIGCA) -现场少量样品快检 基于抗原抗体的免疫原理，抗体抗原的免疫反应特异性强，检出限可达ng级，约15min即可定性分析。 >酶联免疫法(ELISA)适宜大批样品集中检测 定性分析灵敏度高，结构类似物、荧光物质、有色物质对检测的干扰很小，可检测样本本身颜色深的产品。 >高效液液色谱法(HPLC)-专属性较强，重现性较好，假阳性率较低。 吸附能力、溶解能力或其他亲和作用性能不同的各组分在色谱柱中移动速度不同，定性分析基础为保留时间，定量分析基础为峰面积。 ·液相色谱-质谱联用法 (LC-MS/MS)-多成分同时检测，解决色谱分离不完全及假阳性情况样品先通过液相色谱初步分离后进入质谱仪，在离子源中被电离成带电离子，在质量分析器中按离子质荷比(m/z) 的大小进行分离，记录其质谱图。根据谱线位置(m/z)和谱线的相对强度进行定性定量分析。 2015版 2020版 得泰仪器选型 1.液相色谱法(LC)2.液相色谱-串联质谱法(LC-MS) 第一法：黄曲霉毒素((B、B、G、G2)1.液相色谱法(LC) 2.液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)3.酶联免疫法 (ELISA) MHS-60、QSE、涡旋混合、MFV/FV64系列 (在ELISA法) 第二法：赭曲霉毒素A 1.(LC) 2. (LC-MS/MS) MHS-60、QSE、涡旋混合 第三法：玉米赤霉烯酮 1.(LC) 2. (LC-MS/MS) MHS-60、QSE、涡旋混合 第四法：呕吐毒素 1. (LC) 2. (LC-MS/MS) MHS-60、QSE、涡旋混合 第五法：展青毒素 (LC-MS/MS) MHS-60、QSE、涡旋混合、MFV/FV64系列 第六法：多种真菌毒素测定 (LC-MS/MS) 10种真菌毒素 QSE、涡旋混合、MFV/FV64系列 2020中国药典2351真菌毒素测定法智能前处理设备建议选型 MFV智能氮吹仪 FV64 全自动智能氮吹仪 全自动智能双模式氮吹仪 LC法与LC-MS/MS法前处理步骤一致 供试品溶液的制备 取供试品粉末约 15g(过二号筛)，精密称定，置于均质瓶中，加加氯化钠3g，精密加70%甲醇溶液75ml， 高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11000r/min)， 离心5分钟(离心速度 4000r/min)，精密量取上清液15ml， 置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心10分钟(离心速度4000r/min)，精密量取上清液 20ml，通过免疫亲合柱， 15g样品+75ml甲醇溶液+3g氯化钠> 11000rpm， 2min 流速每分钟3ml， 用水20ml洗脱(必要时可以先用淋洗缓冲液10ml洗脱， 再用水10ml洗脱)，去去洗脱液，使空气进人柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22um)滤过，取续滤液，即得。 免疫亲和柱 20ml样品先过柱洗脱液：缓冲液、水、甲醇 3、酶联免疫法-前处理流程 供试品滚的制备称性试品粉末约 2.0g至50ml 离心管中，1加入20ml甲醇，振荡5分钟，室温(20~25℃)下以每分钟3000转离心5分钟，取2ml上清液至10ml干净高心管中，于50~60℃水浴氮气流下吹干，用人Zml去离于水涡动30秒，再加人6ml三氯甲烷振荡2分钟 室温下以每分钟3000转离心5分钟，取下层三氯甲烷液3ml 至10ml离心管中 置氨吹仪上于50~60℃水浴浓缩至干，加人1ml正己烷涡旋30秒，再加人2ml磷酸盐缓冲液涡旋1分钟，室温下以每分钟3000转离心5分钟，取下层液，即得。 2次氮吹50~60℃水浴10ml离心管装2-3ml样品液 12位/26位试管架都要用 第一法：黄曲霉毒素(B、B，、G、G，)-ELISA法 1、抗体：采用常规制备方法分别筛选黄曲霉毒素B和总量特异性单克隆抗体。 2、i酶标抗原：抗原采用常规碳二亚胺法或其他适宜方法将黄曲霉毒素氏衍生物与辣根过氧化物酶反应即得。 3、、磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钾0.2g、、十二水合磷酸氢二钠2.9g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g，加水溶解并稀释至1000ml。 4、酶标抗原稀释液：在(3)中加入8mg牛血清白蛋白，即得。 5、洗涤工作液：在(3)中加入0.5ml吐温-20，即得。 6、底物缓冲液：称取柠檬酸21.0g，加水溶解并稀释至1000ml，作为甲液；称取十二水合磷酸氢二钠28.4g，加水溶解并稀释至1000ml，，作为乙液；量取甲液24.3ml， 乙液25.7ml， 加水稀释至100ml。 7、底物显色液：称取四甲基联苯胺 10mg溶于1ml二甲基甲酰胺，量取5ul加入底物缓冲液10ml、30%过氧化氢10ul，混匀。 8、终止液：量取108.7ml浓硫酸，缓慢加入水中，冷却至室温后，加水稀释1000ml。 9、标准品溶液：精密量取黄曲霉毒素B，标准品溶液，用磷酸盐缓冲液稀释成稀1L含Oug、0.05ug、0.15ug、(0.45ug、1.35pg(测定黄曲霉毒素B1) Oug、0.025ug、0.075ug、0.225ug、0.675 ug(测定黄曲霉毒素总量)的系列标准品溶液，即得。 10、待测样品前处理流程 第一法：黄曲霉毒素(B、B，、G、G，))--ELISA法 测定：黄曲霉毒素B，含量、黄曲霉毒素总量 测定流程： 1、分别采用合适浓度的抗体包被微孔板孔，封闭、干燥等处理微孔板。 2、加入系列标准品溶液，再加入经酶标抗原稀释液稀释至合适工作浓度的酶标抗原，混匀，于25℃反应45分钟。 3、用洗涤工作液洗涤，每孔加入底物显色液100ul， 在25℃下反应15分钟。 4、每孔加入终止液50ul，采用酶标仪于450nm处，参比波长630nm， 测定每孔吸光度值，按下式计算百分吸光率。 6、以黄曲霉毒素B，标准品溶液浓度的对数值(IgC)为横坐标，标准品溶液的百分吸光率为纵坐标，分别绘制黄曲霉毒素氏和黄曲霉毒素总量的标准曲线。 7、另精密吸取上述供试品溶液，按上述方法测定吸光度值并计算百分吸光率，从标准曲线上分别读出供共品中所含的黄曲霉毒素B，和黄曲霉毒素总量的浓度，计算，即得。 可使用ELISA试剂盒酶联免疫法可用于检测病毒 第二法：赭曲霉毒素A LC法与LC-MS/MS法前处理步骤一致 洗脱液：缓冲液、水、甲醇 LC法与LC-MS/MS法前处理步骤一致 供试品溶液的制备 取供试品粉末约20g(过二号筛)，精密称定，置于均质瓶中，加人氯化钠4g，精密加人90%乙腈100ml， 高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11 000r/min)，离心10分钟(离心速度4000r/min)， 精密量取上清液 10ml，置 50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心10分钟(离心速度 4000r/min)，量取上清液 20.0ml， 通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水10ml洗脱(必要时可先用淋洗缓冲液10ml洗脱，再用水10ml洗脱)， 弃去洗脱液，使空气进人柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22pm)滤过， 取续滤液，即得。 20g样品+100ml乙腈溶液+4g氯化钠>11000rpm， 2min 免疫亲和柱 20ml样品先过主 洗脱液：缓冲液、水、甲醇 LC法与LC-MS/MS法前处理步骤一致 供试品溶液的制备 取供试品品末约20g(过二号筛)，精密称定，置均质瓶中，加加聚乙二醇(醇对分子质量8000)5g，精密加人水 100ml，高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11 000r/min)，离心5分钟(离心速度 4000r/min)，滤过，精密量取续滤液5ml， 通过免疫亲合柱，流速速分钟3ml， 用水10ml洗脱，脱脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用1ml甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜 (0.22um)滤过，取续滤液，即得。 20g样品+100ml水+5g聚乙二醇>11000rpm， 2min 免疫亲和柱 5ml样品先过柱洗脱液：水、甲醇 第五法：展青霉素素 LC-MS/MS法-前处理流程 供试品溶液的制备 取供试品粉末约4g(过二号筛)，精密称定，置于均质瓶中，加水20ml 和果胶酶(活性大于1500IU/g)75pl，混匀，40℃下放置2小时，精密加人乙腈60ml， 高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11000r/min)， 离心10分钟(离心速度4000r/min)， 取上清液 20ml， 加人无水硫酸镁-无水醋酸钠(4：1)混合粉末3g：充分振摇2分钟，离心10分钟(离心速度4000r/min)， 取上清液8ml， 通过展青霉素固相净化柱，收集净化液，混匀，精密量取5ml(相当于0.3g样品)，置玻璃试管中，40℃条件下用氮气吹至近干，加2%乙腈溶液用乙酸调节pH值至2)定容至0.5ml，涡旋2分钟使混勾：用微孔孔膜(0.22um)滤过， 取续滤液，即得。 >11000rpm， 2min 5ml样品-近干浓缩40℃水浴 第六法：多种真菌毒素测定法 第6法前处理流程 1.量取供试品粉末约 5g (过二号筛) 2.加入70%甲醇溶液50ml， 超声30min 3.离心后取上清液10ml，用水稀释至20ml，摇匀 4.3ml甲醇和水依次预处理HLB小柱(规格：3ml，660mg) 5. 准确量取3ml样品液过柱，直至有适量空气通过，收集洗脱液 6.再次用3ml甲醇洗脱，收集洗脱液，合并两次洗脱液，待浓缩 7.通过FV64系列，缓慢氮吹至近干(水温40℃) 8. 50%乙腈溶液定容至1ml，用经0.22um滤膜过滤，即得。 LC-MS/MS检测(10种) 黄曲霉毒素(B、B，、G、G，) 伏马毒素(B、B，)、T-2毒素、赭曲霉毒素A 呕吐毒素、玉米赤霉烯酮 氮吹针下降至最低处时 ，可以延长氮吹时间 并自动增加氮吹压力 近干浓缩的批次平行性更好 对照品溶液的制备 1.精密称取黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)、伏马毒素(B1、B2)、T-2毒素、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉需烯酮对照品适量，加甲醇制成每lml 含5ul的溶液分别作为单标贮备溶液； 2.另精密称取呕吐毒素对照品适量，加甲醇制成每lml含5ul的溶液，作为呕吐毒素贮备溶液。再用50%乙腈溶液稀释成下表所述浓度的系列混合对照品溶液。 可根据样品实际情况，制备对照品溶液或基质混合对照品溶液 基质混合对照品溶液的制备-标准曲线 1.取空白基质样品5g，同供试品溶液的前处理方法处理至"40℃条件下用氮气吹至近干" 2.分别精密加入上述系列对照品溶液1.0ml，涡旋混匀，用微孔滤(0.22pm)滤过，取续滤液，即得。 系列混合对照品溶液浓度表 单位(ng/ml) (1) (2) (3) (4) (5) 黄曲霉毒素B 0.2 0.4 1 2 4 黄曲霉毒毒 B 0.1 0.2 0.5 1 2 黄曲霉毒素Gi 0.2 0.4 1 2 4 黄曲霉毒素 Gz 0.1 0.2 0.5 1 2 伏马毒素 Bi 2 4 10 20 40 伏马毒素Bz 2 4 10 20 40 T-2毒素 2 4 10 20 40 赭曲霉毒素A 0.2 0.4 1 2 4 呕吐毒索 50 100 250 500 1000 玉米赤霉烯酮 0.5 1 2.5 5 10 2020中国药典2351真菌毒素测定法第六法：多种真菌毒素测定法 色谱条件 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 0.01%甲酸为流动相A相 乙腈-甲醇(1：1)为流动相B相 0.3ml/min流速下进行梯度洗脱 时间(分钟) 流动相A(%) 流动相B(%) 0~2 95 5 2~2.1 95→60 5→40 2.1~7 60→45 40→55 7~10 45→10 55-90 10~10.5 10→95 90→5 10.5~13 95 5 质谱条件 三重四极杆串联质谱仪 离子源：电喷雾(ESI)离子源 黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)、伏马毒素(B1、B2) T-2毒素选正离子采集方式 测定操作 1.分别精密吸取混合对照品溶液各5ul， 上机分析，测定峰面积， 2.峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线。 3.另精密吸取空白样品、待测溶液5ul，上机分析，测定峰面积。 4.参照标准曲线，计算结果。 MHS-60多样品均质系统2341通则-100ml试管架2351通则-180ml试管架刀头10mm或18mm MultiVortex 多样品涡旋混合器 标准配置已包含12位/26位试管架 50ml离心管X50支 15ml离心管X100支 连购三台特惠、质保延长 QSE-12/24 固相萃取装置 必备耗材 2341通则：HLB小柱、石墨化炭小柱、氨基柱 2351通则：免疫亲和柱、展青霉素净化柱、HLB小柱 MFV-12/24试管规格：试管、离心管、圆底烧瓶， MFV-36试管规格： 试管、离心管 锥形瓶等尺寸范围：010-35mm、H32-200mm体积范围：1-150ml 尺寸范围：010-29mm、 H32-200mm 体积范围：1-100ml DDetelogy FV64 Detelogy 全自动智能氮吹仪针追随式 FV64UP全自动智能双模式氮吹仪针追随式+涡旋式氮吹 LI 2341、2351均须使用，建议选配 15ml具塞刻度离心管(64位管架) 50ml具塞刻度离心管(32位管架) FlexiVap-24 2341需使用，2351不需使用(小样品) 全自动智能平行浓缩仪 标配含100ml尾管浓缩杯48个 THANK YOU MoreIntelligent，MoreEfficient 中药材霉变现象中药材生产、储存、运输、流通过程中，若管理不当，在外界条件（温度、湿度、车间环境、虫害等）和药材自身因素（含水量＞15%、含糖量高等）的综合作用下，易出现霉变现象。真菌滋生对中药材进行分解和消耗，药材中所含的糖类和脂类物质渗出，从而导致粘连、泛油、异味、变色等现象，其有效药用成分含量降低。轻度霉变的药材经二次加工处理后入药，也会造成气味变淡、色泽转暗、品质降低、影响疗效的后果。常见真菌毒素及其危害真菌毒素（mycotoxin)是真菌产生的次级代谢产物，易产生于中药种植、储存环节中。绝大多数的产毒真菌为曲霉属、镰刀菌属和青霉属。曲霉属：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A 等镰刀菌属：玉米赤霉烯酮、T- 2毒素 、呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）和伏马毒素等青霉属：青霉素、桔青霉素等真菌毒素检测方法分类药典2351通则对比相较于2015版药典黄曲霉毒素测定法，2020版药典2351通则中新增赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮测、呕吐毒素、展青霉素对应的样品前处理和分析方法，并增添了多种真菌毒素测定法。1、由于各类真菌毒素毒理不同，容易受污染药材品种也不同。2、处方中含有易污染的药材以及生粉投料的中成药品种应注意相关真菌毒素的检测。3、黄曲霉毒素：粮谷类、种子类、油性成分多的药材品种4、赭曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮：与粮谷类基质类似的药材，如淡豆豉、薏苡仁、白扁豆等5、展青霉素：酸性果实类药材，如枸杞子、乌梅、酸枣仁等新增第六法[多种真菌毒素测定]样品前处理流程1. 量取供试品粉末约 5g (过二号筛）2. 加入70 %甲醇溶液 50ml, 超声30min3. 离心后取上清液10ml，用水稀释至20ml，MultiVortex混匀4. 3ml甲醇和水依次预处理HLB小柱（规格：3ml，60mg)5. 准确量取3ml样品液过柱，直至有适量空气通过，收集洗脱液6. 再次用3ml甲醇洗脱，收集洗脱液。合并两次洗脱液7. 通过FV64或FV64UP缓氮吹至近干（水温40℃）8. 50%乙腈溶液定容至1ml, 用经0.22μm滤膜过滤，即得分析设备（LC-MS/MS）液相色谱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.01%甲酸为流动相 A 相 ，乙腈-甲醇（1 : 1)为流动相B相，0.3ml/min流速下进行梯度洗脱。三重四极杆质谱仪：电喷雾离子源ESI)黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）、伏马毒素（B1、B2）、T-2毒素选正离子采集方式，赭曲霉毒素A 、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮则为负离子采集模式。Detelogy优选智能实验室设备轻松应对药典2351真菌毒素测定法MHS-60多样品均质系统多刀头并联，同时快速均质6位样品兼容5-180ml样品管，转速1800-25000rpm2351通则内，1-5法前处理流程均适用MultiVortex多样品涡旋混合器标配26位&12位试管架，兼容100ml以内的样品转速范围200-3000rpm，触屏可存12个涡旋方法每个方法可设多达6段变速，样品混匀更充分QSE系列固相萃取装置12/24位，每通道配优质独立阀门控制特制加厚真空腔体，可耐80Kpa负压MFV智能氮吹仪通用型圆盘氮吹仪，可选12/24/36位可分组控制启停，每通道配数字刻度微调阀兼容1-150ml样品管，具备观察窗和排水口FV64全自动智能氮吹仪氮吹针自动下降，最多容纳64个样品每氮吹通道多路供气设计，平行性良好延时增压功能，同时自动近干氮吹所有样品FV64UP全自动智能双模式氮吹仪兼容双模式：针追随式或涡旋式氮吹三面透视水浴设计，样品观察更方便DTLabs微信小程序异地远程监控Tip    残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器内浸泡 24小时以上（10%次氯酸钠溶液），再用清水冲洗干净。