赤芍中配方颗粒特征图谱与含量检测方案(液相色谱仪)

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thermoscientific热线800 8105118电话4006505118www.thermofisher.comSCIENTIFIC仅用于研究目的。不可用于诊断目的。◎2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 全新高效液相色谱系统Vanquish Core并联分析芍芍配方颗粒特征图谱与含量测定 秦旭阳柴瑞平金燕 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 Vanquish Core、赤芍配方颗粒、并联、超快速液相色谱 (UHPLC)、用户自定义进样(UDPs)。 摘要 本文基于Thermo Fisher Vanquish Core全新高效液相色谱系统，针对赤芍配方颗粒公示稿中特征图谱与含量测定两种不同的液相方法条件，利用Vanquish液相特有的双泵、双针模块在一台液相色谱上并联进行赤芍配方颗粒特征图谱测试和含量测试，极大的提高分析效率。通过软件自带的方法转化程序将赤芍配方颗粒特征图谱常规方法转换成超快速液相(UHPLC)方法，利用用户自定义进样程序(UDPs)，消除含量测定过程中的溶剂效应。一机多用使得分析效率成倍提升，并有效的降低实验成本。 随着中药政策和市场的发展，以及中药配方颗粒公示稿的颁布，中药配方颗粒的研究已成为当前热点且具有广阔的市场前景。2020Chp颁布的160个品种的中药配方颗粒公示稿中有91个品种采用了超快速液相方法来进行分析，占比约57%，表明超快速液相在中药配方颗粒分析中已有广泛的应用。赤芍配方颗粒为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根经炮制并按标准矛剂的主要质量指标加工制成的配方颗粒，有多种药理功能，主要作用于心血管系统，还具有抗肿瘤、抗内毒素等功效。目前颁布的赤芍配方颗粒公示稿依然采用常规的液相色谱法进行特征图谱和含量分析，而且不同的液相方法不仅占用大量的仪器还增加技术人员的负担。因此，本文采用Vanquish的独特的双泵、加双针自动进样器，实现了一套仪器两条流路(Left、Right system) 独立运行， 无污染无干扰且高效的进行分析(图1)，从而达到事半功倍的效果。 图1 Vanquish Core液相系统连接示意图 2.实验方法 2.1仪器 Thermo Fisher Vanquish Core高效液相色谱仪，泵： Vanquish DualPump(含两个独立三元梯度泵)，自动进样器： Vanquish Dualsampler FT(含两个独立的自动进样针)，柱温箱：两个独立的Vanquish Column Compartment，检测器：两个独立的Van-quish Diode Array Detector。 ( 2.2软件 ) ( Chromeleon 7 .3 ) 乙腈、甲醇、乙醇、磷酸(色谱级， Fisher)，磷酸二氢钾(色谱级， CNW)，去离子水(18.2MQ@25℃， Millipore纯水机)。 2.4样品前处理 2.4.1特征图谱供试品溶液的制备 取赤芍配方颗粒适量，研细，取0.1g，置具塞锥形瓶中，加稀乙醇25mL，密塞，超声处理(功率200W，频率53kHz)30分钟，取出，放冷，滤过，取续滤液，即得。 2.4.2含量测定供试品溶液的制备 取赤芍配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理(功率300W， 频率40kHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL， 置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。 2.5特征图谱测定色谱条件(Vanquish Core Left System) 色谱柱： Thermo Syncronis C18 4.6mm ×250mm， 5um (P/N： 97105-254630) 流动相A：乙腈；流动相B：0.05%磷酸溶液梯度洗脱： 时间(分钟) 流动相A(%) 流动相B(%) 0~25 5→15 95→85 25~34 15一18 85→82 34~35 18→20 82→80 35~44 20 80 44~45 20→45 80一55 45~55 45一47 55→53 55~56 47一5 53一95 56~60 5 95 图3赤芍配方颗粒HPLC转换UHPLC示意图 可以看到赤芍配方颗粒公示稿中特征图谱测试条件为常规液相色谱方法，1.0mL/min的流速下，单次分析时间依然长达60分钟。占用较多的仪器时间并且消耗大量的流动相，实验成本较高。变色龙软件可以有效解决这一问题，使用UHPLC Speed-Up程序即可将HPLC方法自动转换为UHPLC方法。本次实验使用Accucore C18 2.1mmx150mm， 2.6um(P/N： 16126-152130)规格的色谱柱，通过方法转化得到单次分析时间为15分钟的UHPLC方法，流速降低至0.5mL/min，耗时仅为原方法的1/4(图3)。 由于该UHPLC法使用的色谱柱较长，粒径较细，整个梯度压力维持在450bar左右，最高压力为470bar。而最新推出的Vanquish Core高效液相色谱系统最高耐压可达700bar，因此赤芍配方颗粒特征图谱UHPLC法能在Vanquish Core上长期稳定运行，实验结果的各参数指标也均符合公示稿要求(图4)。 图4赤芍配方颗粒特征图谱UHPLC法结果 4.含量测定结果与方法优化 照2.6项下的色谱条件进行分析，结果可以看出由于样品溶液制备采用甲醇为溶剂，而流动相则为甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(40：65)，两溶剂体系极性差异较大，因此产生溶剂效应导致芍药苷主峰严重前沿。且主峰与相邻未知成分峰分离度较差，对主峰的积分影响较大，可能导致含量结果不准确(图5) 图5公示稿方法导致溶剂效应 常规的消除溶剂效应方法包括改变样品制备使用的溶剂、减小进样量等等。但对于审计较为严格的实验室，这些改动势必会带来一些偏差报告等文书工作。而Vanquish Core液相搭配 Chromeleon 7.3软件提供的用户自定义进样程序(UDPs)则可在不改变任何方法的基础上来消除溶剂效应，获得理想的结果。即用户通过自定义进样方式，让样品溶液在进样针内与流动相预混合后再进入流路，以消除溶剂效应(图6)。 样品溶液经自定义进样，实验结果如下图7所示。可见芍药苷峰形对称，且样品溶液中芍药苷主峰与相邻未知成分峰分离度得到较大的改善。因此赤芍配方颗粒含量测定法中使用自定义进样不仅可以消除溶剂干扰，还能改善相邻峰分离度，有利于含量测定结果的准确性。 图7自定义进样消除溶剂效应 5.结论 本文在最新的Vanquish Core高效液相色谱系统基础上，利用双系统并联进行赤芍配方颗粒特征图谱测试和含量测定，能灵活稳健的复现公示稿的结果。在特征图谱测试过程中，使用软件提供的方法转换程序将原本60分钟的常规梯度方法转化为15分钟的超快速梯度方法，分析效率提升4倍。在含量测定过程中，使用软件提供的用户自定义程序，在不改变方法条件的情况下消除溶剂效应，提高了含量测定的准确性，同时避免了审计解释偏差需要的大量的文字工作。因此 Vanquish Core灵活稳健，一机多用的性能，能高效快速的完成赤芍配方颗粒特征图谱测试和含量测定。 ( [1]中国药典委员会.赤芍(芍药)配方颗粒公示稿.中华人民共和 国药典[M]， 15 2020. ) 本文在zui新的Vanquish Core高效液相色谱系统基础上，利用双系统并联进行赤芍配方颗粒特征图谱测试和含量测定，能灵活稳健的复现公示稿的结果。在特征图谱测试过程中，使用软件提供的方法转换程序将原本60分钟的常规梯度方法转化为15分钟的超快速梯度方法，分析效率提升4倍。在含量测定过程中，使用软件提供的用户自定义程序，在不改变方法条件的情况下消除溶剂效应，提高了含量测定的准确性，同时避免了审计解释偏差需要的大量的文字工作。因此 Vanquish Core灵活稳健，一机多用的性能，能高效快速的完成赤芍配方颗粒特征图谱测试和含量测定。