车前草（车前）配方颗粒中特征图谱、大车前苷检测方案(液相色谱仪)

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SSL-CA20-641Excellence in Science Excellence in ScienceLC-254 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 车前草(车前)配方颗粒特征图谱分析及其中大车前苷含量检测 LC-254 摘要：本文参照国家药品标准《YBZ-PFKL-2021023车前草(车前)配方颗粒》，利用 Nexera LC-40D XR系统分析了车前草配方颗粒的特征图谱，并对大车前苷的含量进行了测定。使用岛津 Shim-pack Velox SP-C18色谱柱进行分析，各特征峰相对保留时间均在标准规定的允许范围内；仪器精密度良好，对照药材溶液平行测定6次，6个特征峰保留时间和峰面积的 RSD 值分别不超过 0.32%和1.26%；利用岛津LC-40 自动进样器的“同时注入”功能，很好的解决了测定大车前苷含量时由于溶剂效应而导致的目标峰分叉变形的问题；在药典允许的范围内，通过调整流动相比例，改善了大车前苷目标峰与干扰峰的分离效果；供试品1和2的定量分析结果满足标准要求。 关键词：LC-40D XR车前草配方颗粒特征图谱大车前苷同时注入 中药配方颗粒是以传统中药材为原料，经过提取、分离、浓缩、干燥、制粒、包装等生产工艺，加工制成的一种统一规格、统一剂量、统一质量标准的新型配方用药。 色谱分析车前草配方颗粒特征图谱及其中大车前苷含量的方法。 为保证中药配方颗粒与传统中药拥有同样的治疗效果，需要对其品质进行监控。_O 《YBZ-PFKL-2021023车前草(车前)配方颗粒》中规定了使用超高效液相 本文参照《YBZ-PFKL-2021023 车前草(车前)配方颗粒》，利用 Nexera LC-40D XR 系统分析了车前草配方颗粒的特征图谱，并对大车前苷的含量进行了测定。 实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津 Nexera LC-40D XR 高效液谱色谱系统，具体配置为： 系统控制器： SCL-40脱气机： DGU-405输液泵： LC-40D XR×2自动进样器：SIL-40C XR柱温箱： CTO-40C检测器： SPD-40 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.98 1.2分析条件 1.2.1液相色谱条件-特征图谱分析 色谱柱： Shim-pack Velox SP-C18， 100 mm × 2.1 mml.D.， 1.8 um， 岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：227-32001-03 流动相： A-0.05%磷酸水溶液；B-乙腈 流速：0.3mL/min 柱温：30C 进样体积：1uL 波长：330nm 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为12%，时间程序见表1. 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 5 Pump B.Conc 13 15 Pump B.Conc 17 20 Pump B.Conc 17 25 Pump B.Conc 88 29 Pump B.Conc 88 29.1 Pump B.Conc 12 35 Controller Stop 1.2.2液相色谱条件-大车前苷含量测定 液相条件 色谱柱： Shim-pack Velox SP-C18， 100 mm × 2.1 mm l.D.， 1.8um， 岛津(上海)实验器材有限公司，P/N： 227-32001-03 流动相：A-0.1%甲酸水溶液；B-乙腈 流速：0.3mL/min 柱温：25℃ 进样体积及方式：10uL，同时注入 波长：330nm 洗脱方式：等度洗脱，B相浓度为15% 1.3样品前处理 参照 《YBZ-PFKL-2021023车前草(车前)配方颗粒》，相关样品前处理步骤如下： 1.3.1参照物溶液的制备-特征图谱 取车前草(车前)对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加60%甲醇50ml，加热回流一小时，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取〔含量测定〕项下对照品溶液，作为对照品参照物溶液。 1.3.2供试品溶液的制备-特征图谱 取本品适量，研细，取约0.2 g， 置具塞锥形瓶中，加60%甲醇50ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 1.3.3对照品溶液的制备-大车前苷含量测定 取大车前苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1ml含0.1mg大车前苷的溶液，即得。1.3.4供试品溶液的制备-大车前苷含量测定 取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40 kHz) 30分冷，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 1.4结果判定要求 参照《YBZ-PFKL-2021023车前草(车前)配方颗粒》，特征图谱分析和大车前苷含量测定要求如下 1.4.1特征图谱 (1)理论塔板数按照大车前苷峰计算不低于3000； (2)色谱图中应呈现6个特征峰，大车前苷对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间规定值分别分0.39(峰1)、0.41(峰2)、0.70(峰3)、1.07(峰5)和1.31(峰6)，实测值与规定值偏差不大于10% 图1 特征图谱 1.4.2大车前苷含量测定 (1)理论塔板数按照大车前苷峰计算不低于3000； (2)每1g配方颗粒中含大车前苷应为1.8~10.5 mg 结果与讨论 2.1特征图谱分析 2.1.1S峰确定 以大车前苷对照品溶液进样分析确定Ｓ峰的保留时间为 10.877min. 图2大车前前对照品溶液(粉色)和对照药材溶液(黑色)色谱图 2.1.2特征峰确定 分析对照药材溶液色谱图，以S峰保留时间和其他特征峰相对保留时间及允许偏差范围，并与标准中特征谱图对比，确认其他特征峰。 图3又对照药材溶液色谱图特征峰确定 结果如表2所示：其他特征峰相对保留时间均在标准要求的允差范围内，S峰理论塔板数为44787，远大于标准中3000的要求。 表2特征峰确定 特征峰 No. 保留时间 相对保留时间 相对保留时间允许范围 理论塔板数(USP) 1 4.226 0.389 0.351-0.429 6436 2 4.523 0.416 0.369-0.451 9775 3 7.574 0.696 0.630-0.770 18135 4(S) 10.877 1.000 44787 5 11.609 1.067 0.963-1.177 45417 6 14.386 1.323 1.179-1.441 74502 2.1.3重复性考察 对照药材溶液连续进样6次，考察重复性，色谱图如图4所示。 图4 对照药材溶液色谱图重复性 6个特征峰保留时间和峰面积的RSD 结果如表3所示，其值分别不超过 0.32%和1.26%. 表3 保留时间和峰面积重复性 特征峰No. 保留时间RSD(%) 峰面积RSD(%) 1 0.32 1.26 2 0.29 0.68 3 0.19 0.64 4(S) 0.15 0.61 5 0.13 0.57 6 0.15 0.53 2.1.4样品分析 梓品1和2的特征图谱如图5和图6所示。 图5 样品1色谱图(左)和局部放大图(右，3.4-5.4 min) 图6 样品2色谱图(左)和局部放大图(右，3.4-5.4 min) 样品1和2各特征峰的相对保留时间如表4所示，两份样品中各特征峰相对保留时间均在标准要求的允差范围内。 表4 相对保留时间 特征峰 No. 样品1 样品2 相对保留时间 允许范围 1 0.385 0.385 0.351-0.429 0.403 0.404 0.369-0.451 3 0.700 0.700 0.630-0.770 4 1.000 1.000 5 1.062 1.062 0.963-1.177 6 1.312 1.312 1.179-1.441 2.2大车前苷定量检测 2.2.1溶剂效应及“同时注入”功能的使用 对照品及供试品溶液所用溶剂均为60%甲醇水溶液，标准中规定的流动相为17%乙腈水溶液，在进样体积为10uL时，目标组分峰会受到溶济效应影响而出现色谱峰峰顶分叉现象。 图77大车前苷对照品色谱图(黑色-标准进样模式，蓝色-“同时注入”进样模式) 岛津 Nexera LC-40 系列自动进样器具有“同时注入”功能，在软件上简单设置即可使用该功能。使用“同时注入”功能后，溶剂效应消除，峰形正常。 图8 工作站实时分析窗口“自动进样器”项下的“同时注入”功能设置 2.2.2梯度方法的优化 标准中推荐的流动相条件为17%乙腈水溶液，在该洗脱条件下，由图9可知，供试品中目标峰与其他色谱峰未基线分离。 按照2020年版《中国药典》四部通则“0512高液液相色谱法”规定，等度洗脱时， “最小比例的流动相组分可在相对值±30%或者绝对值±2%的范围内调整”，将有机相比例调整为15%后，分离效果可以满足要求。 图9供试品色谱图(黑色-17%乙腈，粉色-15%乙腈) 2.2.3供试品含量测定 按照标准要求，对供试品处理后进样检测，所得定量结果如表5所示。 表5供试品含量 样品名称 检测结果 称样量 定容体积 含量 (mg/L) (g) (mL) (mg/g) 供试品1 11.501 0.203 50 2.832 供试品2 9.069 0.199 50 2.267 注：要求含量为1.8~10.5mg/g. 结论 本文参照 《YBZ-PFKL-2021023车前草(车前)配方颗粒》，利用 Nexera LC-40D XR系统分析了车前草配方颗粒的特征图谱，并对大车前苷的含量进行了测定。使用岛津 Shim-pack Velox SP-C18色谱柱进行分析，特征峰相对保留时间满足标准要求，方法重复性良好，适合车前草(车前)配方颗粒的分析。 岛津应用云 本文参照《YBZ-PFKL-2021023 车前草（车前）配方颗粒》，利用Nexera LC-40D XR系统分析了车前草配方颗粒的特征图谱，并对大车前苷的含量进行了测定。使用岛津Shim-pack Velox SP-C18色谱柱进行分析，特征峰相对保留时间满足标准要求，方法重复性良好，适合车前草（车前）配方颗粒的分析。