香港牡蛎（生蚝）酶解产物 OEH中蛋白质和脂肪含量的检测

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香港牡蛎酶解产物对雷公藤甲素诱导雄性小鼠生精障碍的影响大连海洋大学学报JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY第 37卷第 6期2 0 2 2年 1 2月Vol. 37 No. 6Dec 22 0 2 2 大连海洋大学学报第37卷249 DOI :10. 16535 / j. cnki. dlhyxb. 2021-301 文章编号 :2095-1388(2022)06-0941-08 香港牡蛎酶解产物对雷公藤甲素诱导 雄性小鼠生精障碍的影响 张锴佳 1,张雪妍 1,秦小明 1,2∗,林海生 1,2,高加龙 1,2,郑惠娜 1,2,曹文红 1,2 (1.广东海洋大学食品科技学院 ,广东湛江 524088; 2.广东省水产品加工与安全重点实验室 ,广东普通高等学校水产品深加工 重点实验室 ,国家贝类加工技术研发分中心 (湛江 ),南海生物资源开发与利用协同创新中心 ,广东湛江 524088) 摘要 :为探讨香港牡蛎 Crassostrea hongkongensis 酶解产物 (oyster enzymatic hydrolysate, OEH)对雄性生精 障碍的保护作用 ,采用雷公藤甲素 (triptolide, TP)连续腹腔注射 ICR 雄性小鼠 21 d,构建生精障碍动物 模型 ,同时按低 、中 、高剂量 (250、 500、 1 000 mg/kg)灌胃 OEH,通过测定 ICR 雄性小鼠精子参数 、脏 器系数 、血清激素水平和睾丸组织酶活性等指标 ,以及 HE 染色观察睾丸组织结构 ,探究 OEH 对生精障碍 雄性小鼠的作用 。结果表明 :中 、高剂量 OEH 能提高小鼠睾丸脏器系数 ; HE 染色结果显示 ,低 、中 、高 剂量 OEH 均可减少精管内空泡化现象 ,并改善生精细胞形态 ,使精管内生精细胞数量恢复至与空白组相 近 ;与模型组相比 ,中 、高剂量 OEH 能极显著提高小鼠精子数量和精子活动率 (P <0.01),各 OEH 剂量 均能极显著降低精子畸形率 (P <0.01);生化指标分析显示 , OEH 能极显著提高睾丸组织中乳酸脱氢酶 (LDH)活性 (P <0.01),且具有剂量依赖性 , OEH 也能缓解睾丸组织的氧化应激 ,极显著提高睾丸组织 中过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)活性 (P <0.01),极 显著降低丙二醛 (MDA)含量 (P <0.01);相较于模型组 , OEH 能极显著提高小鼠血清睾酮 (T)水平 ,降低黄体生成素 (LH)和促卵泡激素 (FSH)水平 (P <0.01),使激素水平恢复至与空白组相近 。研究表 明 , OEH 能够有效改善 TP 诱导的雄性小鼠生精障碍 ,对雄性生殖损伤具有潜在的保护作用 。 关键词 :牡蛎酶解产物 ;生精障碍 ;雷公藤甲素 中图分类号 : S 986.1 文献标志码 : A 随着人们生活习惯的改变和环境恶化 ,不孕不 育问题日益凸显 。目前 ,全球 8%~12%的育龄夫 妻正面临着生殖健康问题 ,其中 ,约有一半的病例 由男性引发 ,涵盖至少 3 000万名男性 ,并以年平 均 0.37%的速度逐年增加 [1-4]。造成男性不育的病 因非常复杂 ,遗传因素 、泌尿系统疾病 、环境毒 素 、高温 、不良生活习惯和过度肥胖等因素均可导 致 [5]。下丘脑 -垂体 -性腺轴激素分泌正常和睾丸组 织完整对促进精子发生具有至关重要的作用 [6-7],有研究报道 ,外源毒素可通过作用于性腺轴 ,导致 激素分泌紊乱 [8],通过氧化应激导致睾丸组织损 伤 ,且精子发生极易受到活性氧 (ROS)的影响 ,从而导致生殖细胞 DNA 损伤 、畸形和凋亡 ,所幸 由氧化应激引起的生殖损伤并非不可逆 [9-10]。 雷公藤甲素 (TP)是中药雷公藤的主要活性 物质之一 ,临床上被用于治疗类风湿 、炎症和肿瘤 等疾病 [11-13]。然而 , TP 对人体具有强烈的生殖毒 性 ,服用过量会出现睾丸萎缩 、激素分泌紊乱和无 精少精等不良反应 [14-15]。 TP 诱导氧化应激和细胞 凋亡是其发挥生殖毒性的主要机理 。王昊等 [16]研 究发现 , TP 通过上调细胞内活性氧水平诱导 TM4细胞凋亡 。 TP 诱导睾丸组织内 ROS 积累进而导致 血睾屏障破坏 ,最终导致睾丸损伤 ,睾丸支持细胞 凋亡 [17]。然而 ,由 TP 诱导氧化应激导致的男性生 精障碍 ,可能通过激活细胞内抗氧化水平而得以恢 复 。香港牡蛎 Crassostrea hongkongensis 俗称生蚝 , 隶属于软体动物门 Mollusca 双壳纲 Bivalvia 珍珠贝 收稿日期 : 2021-12-05 基金项目 :财政部和农业农村部 :国家现代农业产业技术体系资助 (CARS-49) 作者简介 :张锴佳 (1997—),男 ,硕士研究生 。 E-mail: 786115760@ qq. com 通信作者 :秦小明 (1964—),男 ,博士 ,教授 。 E-mail:xiaoming0502@ 21cn. com 目 Pterioida 牡蛎科 Ostreidae,主要分布于中国广 东 、广西地区 [18], 2020年养殖量达到 542.5万 t,产量居四大经济贝类之首 [19]。牡蛎味道鲜美 、营 养丰富 ,具有 “海洋牛奶 ”的美称 [20],同时还具 备抗氧化 [21]、抗皮肤光老化 [22]、促进创伤愈 合 [23]、改善睡眠 [24]和提高学习记忆 [25]等生物活 性 。此外 ,牡蛎酶解产物 (oysterenzymatic hydrol-ysate, OEH)还可以显著提高睾丸间质细胞增殖活 性并促进睾酮分泌 [26]。张雪妍等 [27]发现 ,牡蛎 酶解产物对 TP 诱导的 TM4小鼠睾丸支持细胞的氧 化损伤具有显著保护作用 。可见 ,牡蛎酶解产物对 男性生殖损伤和生精障碍具有潜在的保护效果 ,但 牡蛎酶解产物改善雄性精子发生的作用效果和作用 机理尚不明确 。本研究中 ,以香港牡蛎酶解产物为 研究对象 ,通过腹腔注射 TP 构建雄性小鼠生精障 碍模型 ,探讨了牡蛎酶解产物对改善小鼠生精功能 的作用效果和可能机制 ,以期为牡蛎产品的开发利 用提供科学依据 。 1 材料与方法 1.1 材料 试验用香港牡蛎购于湛江霞山东风水产品市 场 ,购回后立即开壳取肉 ,洗净沥干后于 -80 ℃超 低温冰箱中保存 。 试验动物 :健康 SPF 级 5周龄雄性 ICR 小鼠 ,购于珠海百试通生物科技有限公司 ,动物许可证号 SYXK (粤 ) 2019-0204,饲养温度为 22~26 ℃,湿度为 50%~60%,光周期为 12 h 明暗交替 ,投喂 C60辐照试验鼠维持饲料和蒸馏水 。 药品与试剂 :动物蛋白酶 (酶活力为 8.6×104 U/ g) (广西南宁庞博生物工程有限公司 );雷 公藤甲素 (上海源叶生物科技有限公司 );维生素 E (广州星群药业 ); BCA 蛋白浓度测定试剂盒 (增强型 ) (上海碧云天生物技术有限公司 );小鼠 睾酮 (T)、小鼠促黄体生成素 (LH)和小鼠促卵 泡生长激素 (FSH) ELISA 试剂盒 (均为江苏酶免 实业有限公司产品 );丙二醛 (MDA) (TBA 法 )、总超氧化物歧化酶 (SOD) (WST-1法 )、谷胱甘 肽过氧化物酶 (GSH-PX)、过氧化氢酶 (CAT)(紫外法 )、乳酸脱氢酶 (LDH)测定试剂盒及精 子快速染色液 (快速改良巴氏法 ) (均为南京建成 生物工程研究所产品 );二甲苯 、无水乙醇和中性 树胶 (分析纯 ,国药集团化学试剂有限公司 );伊 红 (HE)染液套装 (Servicebio);扇贝 GBW10024 (GSB-15扇贝 ) (中国地质科学院地球物理地球化 学勘查研究所 );其他试剂均为分析纯 。 仪器设备 : FE28型 pH 计 (瑞士 Mettler Tole-do 公司 ); FD-551大型立式冷冻干燥机 (东京理 化器械公司 ); Lynx6000高速落地离心机 、 Varios-kan Flash 全自动酶标仪 (美国 Thermo 公司 ); VAPODEST-450全自动凯氏定氮仪 (德国格哈特分 析仪器有限公司 ); ICP-MS (安捷伦 Agilent 7500cx);微波消解仪 (Anton PaarMultiwave PRO 41HVT56); CKX41型倒置显微镜 (日本 Olympus 公司 );正置光学显微镜 (日本尼康公司 )。 1.2 方法 1.2. 1 牡蛎酶解产物制备 将牡蛎肉按料液比 1 ∶ 3 (质量比 )加入蒸馏水匀浆 ,调节 pH 至 7.0,按酶活和底物比 1 000 ∶ 1 (U ∶ g)加入动物蛋白 酶 , 53 ℃下保温酶解 5 h 后 ,在沸水浴中灭酶 15 min,离心取上清液 ,浓缩上清液后冷冻干燥制 成牡蛎酶解粉 ,置于 -20 ℃下保存 。 1.2. 2 基本成分测定 分别采用凯氏定氮法 (GB 5009.5—2016)、苯酚 -硫酸法 (GB/T 9695.31—2008)、索氏抽提法 (GB 5009.6—2016)、常压干燥 法 (GB 5009.3—2016)和高温灼烧法 (GB 5009.4—2016)测定粗蛋白质 、总糖 、粗脂肪 、水分和灰分 含量 。 1.2. 3 氨基酸组成测定 采用 GB 5009.124—2016测定牡蛎酶解产物中氨基酸含量 。 1.2. 4 微量元素测定 采用电感耦合等离子体质 谱法 (ICP-MS) (GB/T 5009.268—2016)测定牡蛎 酶解产物微量元素铜 (Cu)、锌 (Zn)、铁 (Fe)、锰 (Mn)和硒 (Se)的含量 。 1.2. 5 动物试验 1)动物分组 。将健康雄性 ICR 小鼠随机分为 6组 ,每组 8只 ,分别为空白组 (C)、模型 组 (M)、阳性组 (P),以及牡蛎酶解产物低 、中 、高剂量组 (OEH-L、 OEH-M、 OEH-H),经适应性 喂养 7 d 后开始正式试验 。 2)剂量确定 。 TP 注射剂量参考 Ma 等 [17]的 方法 ,按 120 μg/kg (体质量 )进行腹腔注射 ;维 生素 E (VE)按 6.5 mg/kg (体质量 )进行灌胃 ; OEH 低 、中 、高剂量分别按 250、 500、 1 000 mg/kg (体质量 )进行灌胃 ,每天一次腹腔注射和灌胃 ,连续进行 21 d。各组动物腹腔注射和灌胃情况如 表 1所示 。 3)试验过程 。每只小鼠的灌胃量及腹腔注射 量为 0.1 mL/10g (体质量 ),试验开始后每天记 录小鼠体质量 ,在末次灌胃和腹腔注射后开始禁食 不禁水 12 h,各组小鼠称量体质量后摘除眼球取 血 ,牺牲小鼠后取出小鼠两侧睾丸及附睾 ,左右睾 丸分别称重后 ,将左侧睾丸立即浸泡于多聚甲醛 中 ,右侧睾丸使用液氮冻存 ,用于生化指标测定 。 表 1 不同组小鼠灌胃及腹腔注射情况 Tab.1 Intraperitoneal injection and gavage of mice in dif-ferent groups 组别 灌胃 灌胃剂量 / 腹腔注射 腹腔注射 剂量 / (mg·kge1) intraperitoneal group gavage (μg·kg)1) dose injection dose 空白组 control 蒸馏水 — 生理盐水 — 模型组 model 蒸馏水 — TP 120 阳性组 positive 维生素E 6. 5 TP 120 低剂量组 OEH-L OEH 250 TP 120 中剂量组 OEH-M OEH 500 TP 120 高剂量组 OEH-H OEH 1 000 TP 120 1. 2. 6 相关指标测定 1)脏器系数 。取出小鼠左 、右睾丸后使用电 子天平称重 ,计算全睾丸脏器系数 ,计算公式 全睾丸脏器系数 = (左侧睾丸质量 +右侧睾丸 质量 ) /小鼠质量 ×100%。 2)精子参数 。取出小鼠左 、右附睾 ,纵向切 3刀后浸入 37 ℃预热生理盐水中 ,并在 37 ℃下孵 育 10 min,浸出精子后使用血球观察并计数总精子 数和活动精子数 。取游离精子于载玻片上 ,使用精 子快速染色液对精子进行染色 ,随后在显微镜下拍 照并计数 200个精子并计算畸形率 ,计算公式为 精子畸形率 =缺陷精子数 /200×100%。 3)睾丸组织切片观察 。将新鲜小鼠左侧睾丸 用固定液固定 48 h 后 ,在脱水机内依次用梯度乙 醇进行脱水而后浸蜡 ,将浸蜡后的组织于包埋机内 进行包埋 ,包埋后的蜡块置于石蜡切片机切片 ,最 大面切片 ,厚度为 4 μm。切片脱蜡复水后用苏木 素和伊红染色 ,封片后采用显微镜镜检并采集图像 分析 。 4)睾丸组织生化指标 。将小鼠右侧睾丸和 9倍体积的生理盐水使用匀浆器匀浆 ,制成质量分 数为 10%的睾丸组织匀浆液 。采用南京建成生物 工程研究所试剂盒分别测定睾丸组织酶活性 (LDH、 CAT、 SOD、 GSH-PX)和 MDA 含量 。 5)血清激素水平 。将小鼠血液在室温下自然 凝固 20 min, 4 ℃下以 8 000r / min 离心 20 min,取上清液 ,使用 ELISA 试剂盒测定血清中 T、 FSH 和 LH 含量 。 1.3 数据处理 试验结果均以平均值 ±标准差 (mean±S. D. )表示 。试验数据采用 SPSS 25.0软件进行统计分 析 ,采用 T 检验法进行差异显著性分析 ,显著性 水平设为 0.05,极显著性水平设为 0.01。 2 结果与分析 2.1 牡蛎酶解产物基本组成成分 从表 2可知 , OEH 基本组成成分中含量最高 的是蛋白质 ,按干基质量计算达到 46.89%,其次 为总糖 ,含量为 35.79%,而脂肪仅占 8.93%。因 此 , OEH 具有高蛋白 、低脂肪的特征 。 表 2 牡蛎酶解产物的基本组成成分含量 (n =3) Tab.2 Content of the proximate compositions of the OEH (n =3) w /% 样品 sample 粗蛋白质 crude protein 总糖total sugar 粗脂肪 crude fat 水分 moisture 灰分ash 牡蛎酶解产物OEH 42. 69±0. 59 32. 58±2. 31 8. 13±0. 35 8. 84±0. 38 7. 64±0. 32 (干质量 dry mass) (46. 89) (35. 79) (8. 93) (8. 39) 2.2 牡蛎酶解产物氨基酸组成 从表 3可见 : OEH 的游离氨基酸和水解氨基 酸均含有 7种必需氨基酸 ,且必需氨基酸与总氨基 酸的比值分别为 48.42%和 36.04%,均高于联合 国粮农组织 (FAO)和世界卫生组织 (WHO)推 荐的理想蛋白模式 ; OEH 中支链氨基酸 (异亮氨 酸 、亮氨酸 、缬氨酸 )占水解总氨基酸的 18.50%。这表明 , OEH 氨基酸含量丰富 、种类齐全 、构成 比例均衡 。 2.3 牡蛎酶解产物微量元素含量 经测定 , OEH 中 Zn 含量最高 ,为 (1 879.9±15.11)μg/ g,其他微量元素含量依次为 Cu>Fe>Mn>Se,分别为 (759.9±15.1)、 (91.2±6. 1)、(23.1±0. 8)、 (1.8±0. 1) μg/ g。 2.4 牡蛎酶解产物对小鼠睾丸组织的影响 本试验中从宏观和微观两个水平验证牡蛎酶解 产物对小鼠睾丸组织结构的影响 。从表 4可见 , TP 和 OEH 对小鼠体质量无显著性影响 (P >0.05); 表 3 牡蛎酶解产物的氨基酸组成 Tab.3 Amino acid composition of OEH g / 100 g OEH 氨基酸 amino acid 游离氨基酸 free amino acid 水解氨基酸 hydrolysis amino acid 门冬氨酸Asp 0. 76 3. 92 苏氨酸Thr∗ 1. 20 1. 65 丝氨酸Ser 0. 90 1. 65 谷氨酸Glu 1. 89 5. 74 脯氨酸Pro# 0. 71 1. 58 甘氨酸Gly 0. 68 2. 66 丙氨酸Ala# 1. 54 2. 21 缬氨酸Val∗# 1. 27 2. 10 蛋氨酸Met∗# 1. 03 0. 83 异亮氨酸Ile∗# 1. 38 1. 77 亮氨酸Leu∗# 2. 22 2. 70 酪氨酸Tyr 2. 46 1. 33 苯丙氨酸Phe∗# 1. 97 1. 39 赖氨酸Lys∗ 0. 74 2. 36 组氨酸His 0. 23 0. 94 精氨酸Arg 1. 28 2. 69 氨基酸总量 TAA 20. 26 35. 52 必需氨基酸EAA 9. 81 12. 80 疏水性氨基酸HAA 10. 12 12. 58 支链氨基酸BCAA 4. 87 6. 57 EAA/ TAA/% 48. 42 36. 04 注 : ∗—必需氨基酸 ;#—疏水性氨基酸 。 Note: ∗—essential amino acid; #—hydrophobic amino acid. 表 4 牡蛎酶解产物对小鼠体质量和睾丸系数的影响 Tab.4 Effects of OEH on body weight and testicular coef-ficient in mice 组别 group 小鼠体质量 / g body weight 睾丸系数 /% testicular coefficient 空白组 control 37. 9±2. 7 0. 85±0. 11 模型组model 36. 6±2. 6 0. 65±0. 07## 阳性组 positive 38. 8±2. 0 0. 72±0. 10 低剂量组OEH-L 38. 5±1. 4 0. 71±0. 06 中剂量组OEH-M 38. 0±0. 7 0. 73±0. 07∗ 高剂量组OEH-H 37. 9±0. 8 0. 74±0. 03∗∗ 注 :与空白组相比 ,#表示有显著性差异 (P <0. 05),##表示有 极显著性差异 (P <0. 01);与模型组相比 , ∗表示有显著性差异 (P <0. 05), ∗∗表示有极显著性差异 (P <0. 01),下同 。 Note:# means significant difference compared with the control group (P < 0. 05),## means very significant difference compared with the control(P < 0. 01); ∗ means significant difference compared with the model group (P < 0. 05), ∗∗ means very significant difference compared with the model group(P <0. 01), et sequentia. 与空白组相比 ,模型组小鼠睾丸系数极显著降低 (P <0.01),与模型组相比 ,阳性组和 OEH-L 组小 鼠睾丸系数略有提高 (P >0.05),而 OEH-M 组和 OEH-H 组睾丸系数均有显著提高 (P <0.05)。这 表明 ,中 、高剂量牡蛎酶解产物可能通过改善睾丸 萎缩提高了小鼠睾丸系数 。 从睾丸组织 HE 染色可以清晰观察到 ,空白组 睾丸生精小管排列紧密整齐 ,精管内生精细胞数量 密集 、分布均匀 、形态良好 ;模型组睾丸精管内生 精细胞明显减少 ,细胞分布紊乱 ,出现大量空泡 ;与模型组相比 ,阳性组 、 OEH-L 组 、 OEH-M 组和 OEH-H 组精管内生精细胞数量明显提高 ,细胞形 态显著改善 ,阳性组与 OEH 组对睾丸组织的改善 效果相近 ,且随着 OEH 剂量的提高 , OEH 对睾丸 组织损伤的改善效果更佳 (图 1)。这表明 , OEH 具有提高生精细胞数量 、减少精管空泡化并维持睾 丸组织结构的作用 ,且具有一定的剂量依赖性 。 图 1 牡蛎酶解产物对小鼠睾丸组织结构的影响 (HE 染色 , 200×) Fig. 1 Effects of OEH ontesticular histologicalstruc-ture in mice (HE staining , 200×) 2.5 牡蛎酶解产物对小鼠精子质量的影响 从表 5可见 :模型组小鼠精子数量极显著低于 空白组 (P <0.01);阳性组和 OEH-L 组小鼠精子 数量虽有增加但与模型组相近 (P >0.05);与模型 组相比 , OEH-M 组和 OEH-H 组精子数量极显著提 高 (P <0.01),精子数量水平与空白组相近 。这表 明 ,中 、高剂量 OEH 能通过改善精子发生 ,提高 小鼠精子数量 。从表 5还可见 :模型组小鼠精子活 动率极显著下降 (P <0.01),经过阳性药物和 OEH 治疗后小鼠精子活动率明显提高 ,中 、高剂 量 OEH 能极显著提高精子活动率 (P <0.01),且 高剂量 OEH 对精子活动率的改善效果优于中剂量 OEH;与空白组相比 ,模型组精子畸形率明显升高 (P <0.01),阳性组和 OEH 组精子畸形率极显著降 低 (P <0.01),改善了精子形态 。这表明 , OEH 具有改善小鼠精子质量的作用 。 通过染色观察精子形态发现 ,空白组精子形态 完整 ,而模型组精子出现大量头部缺陷和短尾等畸 形精子 (图 2)。 表 5 牡蛎酶解产物对小鼠精子参数的影响 Tab.5 Effects of OEH on sperm parameters in mice 组别 精子数量 / ind. 精子活动率 /% 精子畸形率 /% group sperm count sperm motility sperm deformity 空白组control 57±8 64. 90±10. 16 8. 10±1. 19 模型组model 24±8## 33. 03±8. 39## 98. 26±1. 51## 阳性组positive 28±6 43. 90±7. 08∗∗ 84. 25±7. 49∗∗ 低剂量组OEH-L 30±6 31. 76±9. 24 89. 31±6. 69∗∗ 中剂量组OEH-M 48±9∗∗ 52. 60±9. 15∗∗ 84. 21±5. 53∗∗ 高剂量组OEH-H 51±8∗∗ 67. 86±9. 60∗∗ 84. 74±4. 97∗∗ 图 2 牡蛎酶解产物对小鼠精子形态的影响 (200×) Fig.2 Effects of OEH on spermmorphology in mice (200×) 2.6 牡蛎酶解产物对小鼠睾丸组织酶活性的影响 模型组小鼠睾丸中 LDH 活力极显著降低 (P < 0.01),阳性组和 OEH 组 LDH 活性均极显著提高 (P <0.01),且 OEH 对提高睾丸 LDH 活性的作用 具有剂量依赖性 (表 6)。模型组小鼠睾丸组织中 SOD、 CAT、 GSH-PX 活性极显著降低 (P <0.01), MDA 含量极显著提高 (P <0.01);阳性组 CAT 活 性与模型组相近 ,而 OEH 组 CAT 活性极显著提高 (P <0.01);阳性组和 OEH 组 SOD 活性均有明显 改善 (P <0.05),然而低剂量 OEH 组提高 SOD 活 性的效果优于中 、高剂量 OEH 组 ;阳性组和 OEH 组 GSH-PX 活性均极显著提高 (P <0.01);与模型 组相比 ,阳性组和 OEH 组睾丸组织中 MDA 含量均 极显著降低 (P <0.01) (表 6)。 2.7 牡蛎酶解产物对小鼠血清激素水平的影响 从表 7可见 :与空白组相比 ,模型组小鼠血清 中 T 水平极显著降低 (P <0.01),而 FSH 和 LH 水 平则极显著升高 (P <0.01);与模型组相比 ,阳性 组及 OEH 组小鼠血清 T 水平极显著提高 (P <0.01),而 FSH 和 LH 水平极显著降低 (P <0.01)。这表明 ,经过阳性药物和 OEH 治疗后 ,均可有效 改善 TP 药物诱导的激素异常现象 ,使各组小鼠血 清中 T、 FSH 和 LH 水平恢复至与空白组相近 。 表 6 牡蛎酶解产物对小鼠睾丸组织酶活性的影响 Tab.6 Effects of OEH on enzyme activity in testicular tissue in mice 组别 乳酸脱氢酶 / 过氧化氢酶 / 超氧化物歧化酶 / 谷胱甘肽过氧化物酶 / 丙二醛 / (U·g'1 prot) (U·g 1 prot) (U·mg 1prot) (U·mg 1 prot) (nmol·mgg1 prot) group LDH CAT SOD GSH-PX MDA 空白组control 349. 40±67. 94 9. 59±1. 51 14. 28±1. 57 118. 79±16. 55 0. 67±0. 16 模型组model 253. 63±32. 78## 3. 59±2. 06## 7. 32±0. 42## 76. 05±11. 52## 1. 14±0. 30## 阳性组positive 361. 37±84. 70∗∗ 3. 94±1. 29 9. 69±0. 73∗∗ 95. 40±3. 82∗∗ 0. 38±0. 19∗∗ 低剂量组OEH-L 329. 73±38. 40∗∗ 8. 13±2. 28∗∗ 9. 27±0. 89∗∗ 107. 05±10. 90∗∗ 0. 39±0. 12∗∗ 中剂量组OEH-M 458. 74±65. 54∗∗ 7. 35±1. 84∗∗ 8. 49±0. 74∗ 99. 11±13. 49∗∗ 0. 49±0. 20∗∗ 高剂量组OEH-H 506. 19±75. 70∗∗ 9. 82±2. 57∗∗ 8. 12±0. 51∗ 99. 53±7. 01∗∗ 0. 39±0. 13∗∗ 表 7 牡蛎酶解产物对小鼠血清激素的影响 Tab.7 Effects of OEH onserum hormoneconcentrations in mice 小鼠睾酮 / 小鼠促卵泡 小鼠促黄体 组别 生长激素 / 生成素 / (ng·mLL1) group (mU·mL)1) (mU·mL)1) T FSH LH 空白组 control 3. 33±0. 21 16. 78±0. 76 1. 50±0. 04 模型组 model 2. 56±0. 11## 18. 25±0. 65## 1. 76±0. 06## 阳性组 positive 3. 45±0. 28∗∗ 16. 50±0. 81∗∗ 1. 49±0. 03∗∗ 低剂量组 OEH-L 3. 46±0. 19∗∗ 17. 15±0. 23∗∗ 1. 59±0. 05∗∗ 中剂量组 OEH-M 3. 43±0. 19∗∗ 16. 85±0. 61∗∗ 1. 57±0. 10∗∗ 高剂量组 OEH-H 3. 62±0. 23∗∗ 16. 50±0. 26∗∗ 1. 55±0. 05∗∗ 3 讨论 3.1 牡蛎酶解产物营养组成对改善小鼠生精障碍 的作用 有研究表明 ,补充适量支链氨基酸可能具有维 持小鼠精子功能和促进睾酮分泌的作用 [28],补充 精氨酸可改善小鼠精子质量并提高睾酮水平 ,进而 对生殖毒性起到拮抗作用 [29]。本试验表明 , OEH 总氨基酸中含有较高比例的支链氨基酸 (18.5%)和精氨酸 (7.57%), OEH 中高含量的支链氨基酸 和精氨酸有利于提高小鼠睾酮水平 ,从而起到生精 的作用 。此外 , OEH 中还具有较高含量的疏水氨 基酸 ,其游离氨基酸中疏水氨基酸占总氨基酸的 49.95%,水解氨基酸中疏水氨基酸占总氨基酸的 35.41%,高比例的疏水氨基酸有利于与脂类物质 相结合 ,因此 ,可能促进了 OEH 与靶器官和靶细 胞的相互作用 。 锌在人体中含量丰富 ,同时对维持正常生理生 化功能起着重要作用 ,尤其对男性生殖系统发挥着 改善精子形态和调节内分泌系统的重要生理学作 用 [30]。有研究发现 ,精液和前列腺中含有高浓度 的 Zn,其参与多种调控 ,从精子发生到受精各阶 段相关蛋白的构成 ,发挥着控制精子获能 、顶体胞 外分泌和提供抗氧化活性等作用 [31],而睾丸的发 育和雄性激素生成也有赖于一定水平的 Zn,可见 Zn 对男性生殖具有重要作用 。本试验测得 OEH 中 Zn 含量较高 ,为 (1 879.9±11.11)μg/ g, Cu 含 量同样丰富 ,为 (759.9±15.11)μg/ g, Cu 是人体 必需微量元素 ,补充足量的 Cu 可以预防人体多种 疾病 。因此 , OEH 中 Zn、 Cu 等微量元素可能是改 善小鼠生精功能的功效成分之一 。 3.2 牡蛎酶解产物对雄性小鼠睾丸氧化应激的影响 乳酸脱氢酶是一种糖代谢酶 ,大量存在于生精 细胞中并为精子发生 、精子活动提供能量 [32]。本 试验中 , OEH 能极显著提高睾丸组织中 LDH 活 性 , OEH 可能通过提高 LDH 活性改善睾丸能量代 谢的途径 ,促进精子发生提高精子活力 。 氧化应激通过诱导睾丸间质细胞 、睾丸支持细 胞和生精细胞凋亡进而导致生精障碍 ,是男性不育 的重要原因之一 [10]。本试验中 ,通过测定小鼠睾 丸组织中与清除氧化自由基密切相关的 SOD、CAT、 GSH-PX 活性和氧化应激产生的脂质过氧化 物 MDA 含量 ,以评估 OEH 对小鼠睾丸氧化应激的 影响 ,结果表明 ,雷公藤甲素药物可能通过降低小 鼠睾丸组织抗氧化能力导致氧化应激水平升高 ,从 而造成睾丸氧化损伤 。而 OEH 可能通过提高 SOD、CAT 和 GSH-PX 活性 ,提高了小鼠睾丸组织内清除 氧化自由基的能力 ,并抑制睾丸内 MDA 生成 ,从 而缓解雷公藤甲素药物造成的氧化应激损伤 。 3.3 牡蛎酶解产物对雄性小鼠血清激素水平的影响 雄激素属于类固醇物质 ,具有促进雄性性器官 发育 、精子发生和维持性欲等作用 ,是调节雄性生 育能力的关键物质 ,因此 ,通过衡量雄激素水平可 以评估雄性的生育能力 [33]。性激素分泌主要由下 丘脑分泌 GnRH 作用于垂体 ,并刺激垂体分泌 FSH 和 LH,它们分别刺激睾丸支持细胞和睾丸间质细 胞分泌 T,从而形成完整的 “下丘脑 -垂体 -性腺 ”的雄性激素分泌过程 [6]。本试验表明 ,雷公藤甲 素药物可能通过损伤 “下丘脑 -垂体 -睾丸轴 ”减少 小鼠 T 分泌 ,而低 T 水平经负反馈调节机制刺激 下丘脑分泌更多促性腺激素释放激素 ,并作用于垂 体前叶导致小鼠血清中 LH 和 FSH 水平升高 。而 OEH 通过保护睾丸组织 ,维持睾丸正常激素分泌 功能 ,促进小鼠 T 分泌 ,进而恢复小鼠血清中 LH 和 FSH 水平 。这表明 , OEH 可能通过介导 “下丘 脑 -垂体 -性腺轴 ”调节 TP 诱导的雄性生精障碍小 鼠血清雄激素水平恢复至正常 。 4 结论 1) OEH 可有效改善由雷公藤甲素药物引起的 小鼠睾丸损伤 ,提高睾丸系数和精管内生精细胞数 量 ;显著提高小鼠精子数量 、精子活动率 ,并显著 降低精子畸形率 。 2) OEH 可提高小鼠睾丸组织酶活性 (LDH、CAT、 SOD、 GSH-PX),降低 MDA 含量 ,提高生 精细胞能量代谢功能和抗氧化能力 ,同时恢复小鼠 血清激素水平 ,改善雄性小鼠的生精功能 。 3) OEH 改善雄性小鼠生精功能障碍的作用效 果显著 ,可为开发牡蛎资源相关功能的保健产品提 供科学依据 。此外 ,本研究结果可为中药材雷公藤 的临床运用提供新的方案 。但 OEH 成分复杂 ,仍 需对其活性成分进一步分离纯化和深入研究 。 参考文献 : [1] VANDER BORGHT M,WYNS C. 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Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Product of Guangdong Higher Education Institution, National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing (Zhanjiang), South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center, Zhanjiang 524088, China) Abstract : To investigate the protective effects of oyster enzymatic hydrolysate (OEH)from Hong Kong oyster Cras-sostrea hongkongensis on spermatogenic dysfunction in males, male mice with spermatogenic dysfunction were estab-lished by triptolide (TP)intraperitoneal injection for 21 days, and the stomach was administrated with the OEH at low, medium and high doses (250, 500, and 1 000 mg/kg). Sperm parameters, organ coefficient, serum hormone level and testicular tissue enzyme activity were measured in ICR male mice, and testicular tissue structure was his-tologically observed by Hn Estaining to explore the effectof OEHon male mice withspermatogenic dysfunction. The results showed that medium and high dose OEH led to increase the testicular coefficient of the mice-The histo-logical observation showed that low, medium and high dose OEH resulted in decrease in vacuolation and improve-ment of the morphologyof spermatogenic cells in spermatogenictubes, withthesimilar numberof spermatogenic cells in spermatogenic tubes to that in control groupy Significant increase in the sperm number and sperm motility rate was observed in the mice in medium and high OEH dose groups (P <0. 01), and significant decrease in the sperm malformation rate was found in all OEH groups (P <0.01)compared with model group-The lactate dehydro-genase (LDH)activity was significantly increased in testicular tissue due to OEH (P <0.01), with dose-depend- e e n n t t . M M e e a a n n w w h h i i l l e e ,, o o x x i i d d a a t t i i v v e e s s t t r r e e s s s s w w a a s s a a l l l l e e v v i i a a t t e e d d ,, s s i i n n c c e e t t h h e e a a c c t t i i v v i i t t i i e e s s o o f f a a n n t t i i o o x x i i d d a a n n t t e e n n z z y y m m e e s s i i n n c c l l u u d d i i n n g g c c a a t t a a l l a a s se e (CAT), superoxide dismutase (SOD), and glutathione peroxidase (GSH-PX)were significantly increased in the testicular tissue by OEHadministration (P <0. 01), withsignificant decreasein the contentof malondialdehyde (MDA) (P <0 01) There were significantly higher serum testosterone (T)levels and significantly lower levels of luteinizing hormone (LH)and follicle-stimulating hormone (FSH)in the mice in the OEH groups compared with the model group (P <0.01), similar hormone level to those in the control groupHThese findings indicate that OEH can effectively protect spermatogenic dysfunctioninduced by TPin male mice, with potential protectiveeffect on male fertility. Key words : oyster enzymatic hydrolysate; spermatogenic dysfunction; triptolide