水果中多菌灵检测方案(液相色谱仪)

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分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory第27卷增刊2008年5月Vol.27.Suppl.Sur2008-5 水果中多菌灵农药残留检测方法的比较与基质效应研究 陈莹，丛佩华*，聂继云，李静，徐国锋 (中国农业科学院果树研究所，兴城125100) 摘要：对分散固相萃取-高效液相色谱法检测6种水果中多菌灵农药残留的应用进行了评价，获得农药浓度在0.01~3.0 mg/kg 范围内呈良好的线性关系，线性相关系数在0.999以上，平均收率在88%~104.7%范围，方法的 RSD 值小于5%。方法的准确度和精密度都满足要求。并将其与国内外现行的4种多菌灵标准检测方法进行比较，发现并分析了试验中出现的基体效应，指出了分散固相萃取-高效液相色谱法在检测分析多菌灵农药残留的优势。 关键词：水果；多菌灵；检测方法；比较；基质效应 我国是世界第一水果生产大国，水果生产一直是我国农业的重要产业。在我国水果生产中，农药发挥了巨大作用，但随着人民生活水平的日益提高和农产品国际贸易的快速发展，水果中农药残留的问题日益突出，亟待解决。 多菌灵(Carbendazim)，化学名称为2-(甲氧基氨基甲酰)苯并咪唑[2-(methoxy-carbanmoyl)-benzimidaxole]，属于苯并咪唑类药物23]，被广泛用于真菌侵染的产前和产后水果生产中。这类农药在自然环境中降解较慢，而且有一定的毒性4.。研究其检测方法对监控和加强我国水果的安全状况具有重要的意义。我国及国际上规定的水果中多菌灵的最大残留限量分别为0.5、0.1mg/kgl6.1. 苯并咪唑类农药最常用的前处理方法有液液萃取[8]、固相萃取法、固相微萃取I101、分散固相萃取。检测方法法括生物测定21、直接光谱检测3]、薄层色谱检测[14]、免疫化学法15]、气相色谱法161、液相色谱法等。其中分散固相萃取法其以快速、简便著称，已被用于国内外水果、蔬菜的农药残留检测中[18，19]。但在国内将此方法用于苯并咪唑类农药的检测还少有报道。同时，可以看出苯并咪唑类农药检测的相关方法有很多，使用起来较为混乱。但目前对其系统的比较还鲜有报道。本文对分散固相萃取-高效液相色谱法在6种水果中的应用进行了评价，并系统分析了其与 国内现行的多菌灵标准检测方法GB/T5009.188-2003[20]、SN0220-9321]，欧盟的标准检测方法 BSEN 14333-1：2004221、BS EN 14333-3：2004231之间各种参数上的区别，指出了分散固相萃取-高效液相色谱法在分析苯并咪唑类农药方面的优势。 在农药检测过程中会有很多干扰因素影响试验结果。近年来，随着国际上农药残留分析方法的不断规范化，基质效应的干扰问题日益受到人们的重视。由于其对于化合物的准确定性与定量的较大影响，研究分析基质效应也是在进行方法开发或方法验证过程中不可缺少的一个重要环节。国内外现在已经有一些人在研究这个问题，但大多相关研究是集中在气相色谱和液相色谱-质谱串联的仪器检测时的情况24]。本文在试验过程中发现了苯并咪唑类农药在液相色谱法检测时出现的基质效应，并尝试运用合适的方法进行消除，获得较好的效果。 实验部分1.1材料和方法 使用的主要试剂有：分散吸附剂： PSA吸附剂(平均粒度：45m)、Ci8吸附剂(平均粒度：45m)，艾杰尔科技有限公司。 农药标准品：多菌灵(纯品，北京康林科技有限责任公司)。流动相：甲醇(色谱纯)、KH，PO4(优级纯)、磷酸氢二钾(优级纯)、去离子水，流动相 ( * 作者简介：陈 莹(1983-)，女，硕士研究生； E mail： congph @163. com ) 需经0.45m的溶剂滤膜过滤后使用。 试剂： CHC2、乙酸乙酯、正己烷等没有特殊说明的均为分析纯。 1.2 仪器与设备 固相萃取柱：Cs小柱、二醇基小柱(北京艾杰尔公司)。 高效液相色谱仪：日本岛津公司 Class-vp10AVP型， ODS 反相色谱柱， VP-ODS， 150 mm ×4.6 mm. 紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司 TU-1800SPC。 1.3.9实验方法 1.3.1 样品的抽取按NY/T 789251抽取样品，用蒸馏水洗净，擦干，四分法取可食部分，切碎，用组织捣碎机捣成匀浆，备用。 1.3.2：样品的处理 <蔬菜、水果中甲基托布津、多菌灵的测定>(GB/T5009.188-2003)前处理方法；<出口水果中多菌灵残留量检测方法>(SN0220-93)前处理方法；(BS EN 14333-1： 2004)前处理方法；< Non fattyfoods-Determination of benzimidazole fungicidescarbendazim. thiabendazole andbenomyl ( ascarbendazim)-Part 3： HPLC method with liquid/liquid-partition clean up> (BS EN 14333-3：2004)前处理方法； 分散固相萃取前处理方法：称取样品10g于50 mL可封闭离心管中，加入10 mL乙腈，旋涡混匀器混匀30s，加入2 g NaCL 后振荡混匀3 min。以 4000 r/min 离心5 min。吸取上层乙腈相1.5 mL到装有 40 mg ODS 吸附剂和 40 mg PSA吸附剂的2mL 离心管中。振荡，以6000 r/min 离心3 min。移取上清液1mL到液相色谱进样瓶中。 1.3.3 分析条件紫外分光光度计：直接测定吸光度而进行定量，定量时采用作图法，求得校正 吸光度，再根据校正吸光度和多菌灵的浓度关系绘制成标准曲线。测定出的试样的校正吸光度值，后与标准曲线比较，计算试样中农药的含量。分析过程中注意扣除背景值。 高效液相色谱：谱动相，V(甲醇) ：V(H PO4缓冲液)(pH7.2~7.5)=4060；流速0.8 mL/min；柱温40℃；二极管阵列检测器，检测波长为 285nm。以保留时间定性，峰面积定量。 2结果与分析 2.1标准曲线的线性范围、精密度 2.1.1 紫外分光光度法的标准曲线 根据GB/T5009.188-2003进行标准曲线绘制如图1，其标准曲线方程为 y=0.1217x-0.0219， R’ 为0.9997。可以看出紫外分光光度法在浓度0.5~3mg/kg范围内有很好的线性关系。 图1 多菌灵紫外分光光度法标准曲线 2.1.2高效液相色谱标准曲线 取适量多菌灵和噻菌灵标准储备液，用甲醇稀释，配制浓度为0.05、0.1、0.5、1、2、3 mg/kg 的标准溶液，甲醇定容。在旋涡混匀器上混匀，过 0.45pm膜后，用高效液相色谱分析，采集色谱图，绘制标准曲线。由表1可以看出，二极管阵列检测器检测的结果，多菌灵在0.05~3 mg/kg 范围内有很好的线性关系，R是0.9997，并且检出限(LOD值)分别0.0458 mg/kg，检出量(LOQ值)分别为0.1388mg/kg。能够满足国内外对多菌灵的最大残留限量要求。 表1 多菌灵高效液相色谱法标准曲线的线性关系和准确度 分析物 标准曲线方程 R LOD/(mg/kg) LOQ/(mg/kg) 多菌灵 y=(5.183x-0.0641)10° 0.9997 0.0458 0.1388 注：LOD，检出限；LOQ，检出量 2.2分散固相萃取法的精密度和准确度 以苹果、香蕉、桃、桔子、葡萄、草莓等6种水果为试材，添加0.05、0.1、0.5 ppm3个浓度的添加，进行精密度和准确度试验。每个品种每个 添加浓度取3个平行样，按分散固相萃取-高效液相色谱方法进行测定，结果见表4。数据显示，试验获得的回收率范围在90.7%~104.7%，方法RSD 值范围在1.1%~4.9%，符合要求[261。 表26种水果的添加回收试验结果(n=3) 农药 添加浓度/(mg/kg) 苹果 葡萄 香蕉 桃 桔 草莓 多菌灵 0.05 93.8±4.2 91.8±4.3 98.4±4.8 95.11±4.7 96.4±4.3 97.2±4.0 0.1 100.2±2.8 98±3.1 99.2：±2.3 98.7±2.2 97.5±2.2 99.6±2.2 0.5 100.5±1.2 101.2±1.4 103.8±1.0 104.7±1.4 102.1±1.5 100.8±1.8 2.3 前处理方法比较 4种检测方法中的前处理方法可归类为液液分配法(GB/T5009. 188-2003、BS EN 14333-3：2004)、固相萃取法(SN0220-93、BS EN 14333-1：2004)。通过对其分类比较得到的结果如表1。可 以看出无论是时间、成本、有机溶剂使用量分散固相萃取方法都是最小的，经济、少污染，而且其步骤最少利于操作。通过具体的试验操作还可以看出国家标准 GB/T5009.188-2003的试验数据后处理过程十分的繁琐。 表3前处理方法比较 比较项目 液液分配 固相萃取 分散固相萃取 GB/T5009.188-2003BS EN 14333-3：2004 SN0220-93 BS EN 14333-1：2004 时间/h 5~6 2 0.5~0.75 成本(RMB) 10 >20 8 步骤 混合、过滤、多次分配、蒸发、浓缩 混合、过滤、过柱、蒸发、浓缩 振摇、离心 有机溶剂使用量/mL >100 60~100 <12 注：固相萃取方法中的小柱的不同成本会有一些变化 2.4 各方法精密度和准确度结果比较 对添加0.05、0.1、0.5、1.0、3.0 ppm5个浓度梯度多菌灵农药标准样品的苹果样品进行回收率试验。结果如表3所示，可以看出GB/T5009.188-2003最小检出浓度是 0.5 mg/kg， 而其他方法0.05 mg/kg 以上浓度都可以检出。原因是 GB/T5009.188-2003是用紫外分光光度计进行检测，其灵敏度要低于液相色谱法。比较平均回收率可以看出总体上液液萃取的前处理方法回收率要低于固相萃取的结果，而且由于液液萃取中的实际操作原因，平行样品之间获得的结果差异要大许多，因此其 RSD 值总体上要高于固相萃取法。而且从提取效果比较来看，液液萃取过程中十分容易出现由于pH值的微小区别产生明显的乳化现象，而导致试验结果的变化。同时，固相萃取法 的样品通过固相萃取柱处理后，试样中的色素等大分子杂质去除的更加干净，更有利于保护液相色谱柱和去除对试验结果的干扰。 固相萃取法包括 SN0220-93和 BS EN 14333-1：2004。两者的原理不甚相同， SN0220-93使用的是Cs小柱，是利用多菌灵农药处于不同溶剂情况下的极性区别进行分离；而 BS EN 14333-1： 2004使用的是二醇基小柱，是利用多菌灵在不同酸碱性条件下的电荷区别进行分离。两者的结果有细微的区别。 综合表2~表4可以看出，由于分散固相萃取法前处理过程中的步骤简单，溶液在容器中转移的次数少，因此其 RSD 值比上述几种方法相应浓度的 RSD 值小，重复性好，精密度和准确度高。而且成本较低、试验过程中有机溶剂的使用量较好， 有利于操作者的健康和环境保护。 表4 不同方法的回收率试验结果 添加浓度 平均回收率±RSD，% /(mg/kg) GB/T5009.188-2003 SN0220-93 BS EN 14333-1：2004 BS EN 14333-3：2004 0.05 一- 92.0±6.0 92.7±5.4 80.7±9.5 0.1 - 92.7±4.3 93.0±4.7 86.7±5.9 0.5 86.0±10.1 96.3±4.2 97.1±2.7 94.2±5.0 1 101.9±8.7 97.3±3.8 97.8±2.1 95.7±4.1 3 107.1±6.5 101.2±2.1 101.3±1.3 100.5±2.7 注： n=3；RSD=相对标准偏差 2.5 试验的基质效应 色谱法检测的过程中产生基体效应的原因有很多，如样品基质的种类和浓度，待测物的化学结构与性质等27。在试验过程中，欧盟标准检测方法BS EN 14333-3：2004中出现了实际样品与标准样品的保留时间差异较大的现象，响应值也发生了一些变化。分析其原因，多菌灵分子是一种极性分子，在不同环境的条件下会有不同的存在状态。在不同pH的溶液中，会结合不同的基团，导致定性和定量因子的变化。在 BS EN 14333-3：2004的前处理方法中，多菌灵的分离是利用其在不同pH条件下在不同极性溶剂中的溶解程度不同的原理。在调解 pH的过程中，多菌灵的状态就有了变化。如图2所示。 t/min 图2基质效应 1-基质配标样；2-样品；3-标准样品 由于使用常用的将标样添加到基质溶液中的补偿办法281还是不能很好的消除基质效应，如图2所示。因此本文将基质匹配标准溶液校准方法以及标准添加法结合使用进行基质效应的消除。基质标准的配制：经过平行样测定，确定其中不含有待测组分的样品进行配制，在空白基体提取 液里加入定量的农药，配制成一定浓度的基质标准，根据方法继续进行净化与测定步骤。得到的响应值做标准曲线。根据校准后的标准曲线进行样品的定量计算。 3讨论 国内外报道的检测多菌灵农药的方法有很多，从国内外的标准检测方法可以看出，较常用、使用的检测方法有高效液相色谱法、紫外分光光度法。但从灵敏度上进行比较可以看出，高效液相色谱法的灵敏度更高，且数据处理等后处理操作更为简单。同时，随着液相色谱的操作系统的逐渐智能化，这种优势会更显突出。 多菌灵的检测常用的前处理方法有液液萃取法和固相萃取法，两者相比固相萃取法的重复性、重现性要高于液液萃取法，而且操作更简单，提取效果更好，更利于保护检测仪器。同时，固相萃取法使用的有机溶剂少，有利于环境保护。但与分散固相萃取法相比，上述两种方法的操作都较复杂，且成本较高。本文中分散固相萃取法获得了较好的结果。 多菌灵是极性物质，因此其分离提取方法的原理多是利用其极性和不同环境条件下带不同电荷的性质。在固相萃取和液液萃取方法中就是利用这种原理。但是在这些方法中由于常涉及pH的变化使多菌灵分子带上不同的基团，而出现样品与标准样品保留时间或峰面积等因素不同的基质效应，产生不同的检测结果。运用常用的空白基体萃取液配制标准样品的方法并不能很好的消除影响，因此同时采用基质匹配标准溶液校准方法以及标准添加法进行补偿，获得较好的效果，使 定性、定量分析顺利进行。但在包括多菌灵的多农药残留检测当中，处理条件的选择很难照顾到多菌灵的特性而产生基体效应。如我国较先进的多残留检测方法2能够检出的农药中就没有多菌灵。分散固相萃取法的原理是将试样中的杂质去除，保留目标药物进而进行检测的方法，其不涉及目标药物的性质问题，因此很适合像多菌灵这种极性药物的检测，为包含多菌灵的农药多残留检测提供了新的思路。 ( 参考文献 ) ( ] 优势农产品国内外质量标准比对分析报告.北京：农业部科技发展中心，2003 ) ( 21 ] 刘乾开，朱念国.新编农药使用手册(第二版).上 海：科学技术出版社，1999. 309 ) ( [3] 农业部农药检定所.2007农药管理信息汇编.北京：中国农业出版社，2006 ) ( 4 林 有.农药应用用全.北京：农业出版社，1989. 300 ) ( 5 Minta M， Wilk I ， Z M UDZKI J. 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