PCR 技术中介绍检测方案(基因扩增仪)

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第4期2011年8月No.4： Aug. 2010现代科学仪器Modern Scientific Instruments·128· 第4期2011年8月赵晓光等：高速PCR技术. 129· 新仪器新技术 高速 PCR技术 赵晓光 薛 燕 (国家生物医学分析中心 北京 100850) 摘 要 PCR技术是现代分子生物学最基础的技术之一，在实现扩增效果的同时如何缩短 PCR 的实验时间成为实验工作者亟待解决的问题。本文从高速 PCR的概念入手，阐述了实现高速 PCR 仪器技术的原理、优势，及可能的应用。指出了高速PCR 技术的核心在于，不仅要提高 PCR 仪器的升降温速率，更重要的是提高 PCR 样品温度与金属样品槽的一致性，从而达到缩短变性，退火，延伸等停留时间的目的，进而大大的缩短PCR 时间。同时也指出，高速PCR 对提高反应特异性带来的好处等。 关键词 PCR；高速 PCR；自适配技术；产物特异性 中图分类号 TH77 Rapid PCR Technology Zhao Xiaoguang，Xue Yan (National Center of Biomedical Analysis，Beijing，100850) Abstract PCR technology has been one of the basic and key technologies of Modern Molecular Biology.Howto shorten PCR time is a question badly needed to be solved on the premise of PCR amplification effect. In the paperwe describe the concept， principle， advantage and application of rapidPCR technology which can highly increase thePCR speed. As addressed in the paper， the Key ofrapid PCR is not only to increase the heating and cooling rate of PCRmachine， more important， it relays on reducing the temperature difference between the PCR module and sample solution，so that the holding time of denaturation， annealing， elongation could be shorten， and the whole PCR time could be shortendramatically. While， rapid PCR could also lead to another benefit to improving the specificity of PCR. Key words PCR；rapid PCR； Self-Adapting-Container technology； product specificity 1 PCR 仪的温度控制 PCR(Polymerase chain reaction：聚合酶链反应)即是在体外模拟体内 DNA 复制的过程，用一对寡聚 DNA 作为引物，通过加温变性-退火- DNA合成这一周期的多次循环，使目的 DNA片段得到扩增。PCR 反应通常在热循环仪(DNA 扩增仪、PCR 仪)中的小型反应管，以 10-200微升的反应量进行。热循环仪对反应管进行加热和冷却，达到每个反应步骤所需的温度。一个常规PCR扩增温度循环：94℃变性保持1分钟；55℃退火保持2分钟；72℃延伸保持2分钟，一个循环持续5分钟。热循环仪的变温方式和性能是 PCR 技术的核心与关键，直接决定PCR 的效率和 DNA产物的质量与数量。自1985 年 Mullis 等人发明 PCR技术以来，出现多种变温方式的 PCR仪[2，3]，哪一种变温方式也难十全十美，目前主要有两种变温方式的 PCR 仪，一种是AB、伯乐、耶拿、Eppendorf、Biometra 等公司的 PCR 仪所采用的半导体制冷器(peltier：帕尔帖)的PCR 仪；另一种是以罗氏和 corbett等公司采用专利的离心空气浴 PCR 仪(由于数量较少，本文暂不讨论)。温度控制的主要参数包括；温度的准确性、均匀性和升降温速度。 采用半导体制冷器4的PCR 仪利用半导体制冷器既可以加热又可以制冷的特点，经过导热介质金属样品槽，控制 PCR 样品管的温度。主要特点：金属样品槽(银或铝)热传递速率快、易于自动化(没有机械部件)、体积小、控温简单、稳定可靠、环境影响小。主要缺点是金属样品槽的均匀性不好，大部分产品的温度均匀性只能控制在±0.3℃左右。近几年这类产品的一个主要突破就是升降温速度的提高，这也是许多厂家喜欢大力宣传的指标，主要原因是关键部件半导体制冷器升降温速度的技术突破，表1是目前几种主要 PCR仪的温度指标。其中尤以耶拿 SpeedCycler2 PCR仪最为突出，升温速率高达15℃ /sec，降温速率10℃ /sec，在8~15分 表1.几款常规PCR 仪的主要温度参数 品牌 Analytik Jena ABI Biorad Eppendorf Biometra 型号 SpeedCycler Veriti 96 Well Fast C1000 Mastercycler pro s Tprofessional 升温速率 最大15℃/s 5℃/sec 5℃/s 6 ℃/sec 最大6℃/s 降温速率 最大10℃/s 4.25 C/sec 5℃/s 4.5 ℃/sec 最大4.5℃/s 样品槽材质 银质镀金 合金 铝质蜂巢式 银质 纯银镀金 加热元件 高速Peltier Peltier Peltier Peltier， 三组回路技术 Peltier 温度控制范围 4℃-105 ℃ 4-99.9℃ 0-100℃ 4-99℃ 3-99℃ 控温准确性 ≤±0.2℃ ±0.25℃ ±0.2℃ ±0.2℃ ±0.1℃ <±0.15Cat 55℃ 控温均匀性 ≤±0.3℃ at 72℃ <0.5℃ ±0.4℃ <±0.3℃ at 20-72℃ <±0.25℃at 72℃ <±0.4℃at 95℃ 钟内即可完成标准的30个PCR 循环，创建了高速PCR的业界新标准。当然高速 PCR 不仅仅是节约时间，同时也具有应用意义! 2 高速 PCR的标准与意义 高速PCRS这一概念最早是由在PCR 和定量PCR技术领域享有盛誉的快速 PCR 先驱者、美国犹他大学的 Carl Wittwer 教授在二十世纪九十年代提出的，他认为在30分钟内完成30个循环的PCR扩增实验，才可称之为高速 PCR。现在该定义已经被业界广泛认可接受，成为衡量是否为高速 PCR 的标准。 众所周知，目前常规 PCR仪运行一个完整的PCR 实验大约需要1~3小时，一天下来只能做3~4次PCR实验，这对于样品量大或使用者多的实验室来说，安排实验工作就非常不方便，严重影响工作效率。而高速 PCR 可在8-30分钟内即可完成一个常规 PCR 实验，大大缩短了 PCR 实验的时间，别小看这节约下来的几十分钟，一天下来就可以多运行好几轮了。而且缩短PCR 反应时间，对医院、生产线产品质量控制、现场检测和应急处理等对时间敏感的场合，更有实用意义。 除了反应速度快外，高速PCR的另一个突出优点是可以提高 PCR 产物的特异性。影响 PCR产物特异性的因素有很多，其中引物和模板的正确配对是最为关键的，而这又与引物的退火温度和时间密切相关。在退火温度一定的条件下，退火时间越短，越有利于提高准确配对的引物一模板的比例，进而提高扩增产物的特异性。由于高速 PCR 技术能使样品温度在非常短的时间内达到设定温度，所以可以大大缩短退火时间，进而扩增出高特异性的 PCR 产物。 3 高速PCR仪的原理与关键技术 为什么普通PCR仪的PCR反应需要1~3个小时呢?比如扩增 1kb 片段的目的基因，常规的PCR 程序为：95℃预变性2min，95℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸1min，30个循环后再充分 延伸2min。即使不考虑升降温变化所需的时间，单纯计算 PCR 三个步骤所需的时间，一次循环需2min，30个循环也需要 60min。有个问题可能有些人没有想过，为什么变性一退火一延伸的步骤必须停留那么长的时间?缩短一点行不行?主要原因是热量从仪器传递到样品要通过半导体制冷器一传热介质金属样品槽→样品管→样品几个环节，而每个环节的热传递效率都会影响样品的实际温度变化，般情况下样品的温度变化与加热模块相比会有时间上的滞后。当金属样品槽达到了设定温度时，样品实际温度还远远没有达到设定温度。图1为普通PCR仪金属样品槽温度和样品实际温度之间的差别，从中可以清晰地看出这一现象，当样品槽温度达到设定的50℃时，样品的实际温度还在65℃左右，而15s后，两者的温度还有1.5℃的差别。所以进行常规的PCR时，各步骤的停留时间必须足够的长，以使样品的温度达到设定的温度。 图1普通PCR仪样品槽温度和样品实际温度之间的差别 所以要实现高速 PCR 反应，就必须解决两个关键问题，提高 PCR 仪的变温速率和热传导效率。这要取决于基础器件、材料、技术和方法的突破与创新。仪器方面，最主要的是高速大功率半导体制冷器的技术突破，因为他是PCR 仪温度控制的源动力和高速PCR的根本。金属样品槽采用导热性好的银材质，由于银的热传导速率两倍于铝，银槽PCR 仪的升降温速度及温度均匀性明显优胜于铝槽，银槽再镀金以避免银被氧化，可以最大幅度地提高银槽的导热效率。选择薄壁 PCR 管和减少反应体系，也可显著提高 PCR 管内样品的温度响应时间。在追求 PCR 速度越来越快的同时，反应体系越来越少也是一大发展趋势，这不仅可以节省样品和试剂用量，还可以加快样品的温度变化，和水壶里的水越少越容易烧开是一个道理。以前PCR 反应体系通常为50uL，后来改进为25或 20uL，现在已经有一些产品的反应体系能降低至5~10uL，这也是实现高速PCR的一个前提条件。 金属样品槽导热虽然好，但是与反应管，很难做到无缝接触，影响样品槽和样品间的热传递效率。各厂商生产产 PCR 仪金属样品槽和PCR 管也多少有些不同。这也是为什么有些厂家会推荐使用者使用某种特定品牌的样品管的原因。针对这个问题，耶拿公司推出专利的自适配容器技术(SAC：Self-Adapting-Container)。基本思路是让样品管形状适应样品槽的形状，随样品槽的形状而变化。技术关键是采用聚丙烯材料制成管壁仅50 um 极薄且富有弹性的 PCR管，在PCR 加热过程中，管内空气受热膨胀而对管壁施加压力，管壁就会像皮肤一样紧密贴合在样品槽上，实现无缝接触，如图2所示，使热量能快速穿过极薄的管壁传递到样品上，使样品温度和样品槽温度几乎同步变化，如图3所示，从而可大大缩短PCR 循环各步骤的停留时间，把先前的几十秒缩短到几秒，进而实现高速PCR。可能处于专利的考虑，这种PCR 管只能在耶拿自己独有的一种低缘紧凑型的银质镀金样品槽上使用，由于这种样品槽的深度仅有 5mm，减少了银质镀金样品槽的质量，因而进一步提高了银质镀金样品槽与半导体制冷器之间的温度响应速度。比如说上述的常规PCR程序，如果改用 SAC 高速PCR技术，可实现变性2s，退火2s，延伸10s，升降温变化速率大于 10℃ /s，30个循环可以在 25min 甚至更短的时间内轻松完成。 图2 PCR 开始后，自适配样品管壁会紧密贴合在样品槽壁上，实现能量的快速传递 No Gradient Option RequiredSample follows Block almost 1：1 图3高速PCR过程中，样品温度与加热模块温度几乎保持同步 在此，大家可能会产生一个疑问，高速PCR 是否要使用特殊的高速 PCR 聚合酶?将延伸时间或退火停留时间缩短，是否可保证聚合?众所周知，延伸时间是受扩增产物的长度决定的，大家形成的常规概念是按 1kb/min 来设定。但实际上，普通 Taq 酶的扩增效率大约为35~100bp/s，扩增 1kb 仅需要10~30s。因此，如果产物长度在 300bp，而且采用热平衡时间很短的高速 PCR 仪，10s的延伸时间就已足够。问题是常规PCR中，要保证样品温度要在延伸温度下停留10秒，须将模块温度停留30秒以上才能实现，而高速PCR由于保证了样品温度和金属样品槽温度的一致性，因此，将模块温度停留10秒即可。另外，近年来一些公司推出了一些快速的Taq 酶，例如， Bio-rad公司的 Ssofast 酶 ，Takara 的 TaKaRa Z-Taq 酶等，这些酶的扩增速度比普通 Taq 酶快5~10倍，使用这些酶，使用高速 PCR 仪时，延伸时间可以进一步缩短。 4 结束语 PCR技术在生命科学研究领域是一个非常基础又非常重要的技术，随着各种应用需求越来越多，人们对能拥有一台速度快、样品量小、产物特异性好、试剂无特殊要求、操作简便的 PCR仪的要求也越来越强烈，高速 PCR 技术将在不断地改进创新中成为PCR 发展的一个必然趋势。 ( 参考文献 ) ( [11 黄培堂，俞炜源. PCR技术原理和应用[M].北京：中国科学 技术出版社，1990：1-9 ) ( [21 张文超.聚合酶链反应(PCR)技术与基因扩增分析仪器(PCR仪).生命科学仪器，2005，3(3) ) ( 3] 章春笋，徐进良.时域式PCR生物芯片中温度动力学研究进 展.现代科学仪器，2005(03)：13-17 ) ( 4 王南林，吴太虎.半导体制冷与医疗仪器.医疗卫生装备， 2002，6：28-30 ) ( 5 Wi t twer， C.T.et a l . ，in Mullis， K.et al.，(Eds.). The poly-merase chain reaction. Birkhauser， Boston(1994)：174 -1 81 ) ( [6] 高惠兰，方福德.聚合酶链反应技术.现代科学仪器，1993，(01) 07-10 )