上海通微毛细管电色谱分离蛋白质及多肽

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毛细管电色谱分离蛋白质及多肽 摘要： 这项研究描述了一种新的毛细管电色谱方法，该方法用熔融硅毛细管内部蚀刻柱，再经过后序的硅烷化/氢化硅烷化反应处理，两种不同的有机物，十八烷基和二醇基，被附在蚀刻过的毛细管内壁上，这两种柱子同空管柱用于多肽(血管紧张肽)和蛋白质的分离情况的比较，从而得出蚀刻过程充分地增加了内壁的表面积和溶质与键合相间相互作用的结论，因为毛细管被十八烷基和二醇基改变了性质，这两种改性柱的分离能力是不同的，估计是因为两种配位体的化学性质的不同，与空管柱中的分离仅依靠电泳速度不同，相同的物质在相同的实验条件下，不同键合相蚀刻毛细管柱中的分离因子是不同的。 关键词：电色谱；毛细管柱；蛋白质；多肽 1. 引 言： 毛细管电色谱(CEC)是一种集高效毛细管电泳(HPCE)和高效液相色谱(HPLC)的分离机制于一体的方法，，它的溶质流动是通过一个电驱动原理，分离机制是不仅依靠溶质一固定相间的反应作用，还有电渗流的作用。在最普通的毛细管电色谱模式中，毛细管填充了化学改性的硅胶颗粒，固定相如同HPLC中一样。，一个柱塞，置于溶质到达检测窗口之前的位置，以用于阻止固定相的流失和光信号的失真。塞子和固定相颗粒都可能导致气泡的产生，从而导致电渗流的中断，为了最大限度地减少气泡产生的可能性和排除堵塞，这在小直径的管子内是很困难的，因此发展了一种在毛细管内壁蚀刻的毛细管电色谱方法，这个过程同在气相色谱中为了增加毛细管柱内壁表面积而涂上一层聚合物的方法相似，在精确控制的温度和反应时间下使用了二氟化氢铵作蚀刻剂。较早的研究描述在300-400℃时蚀刻毛细管3-4小时，这些条件明显地增加了表面积，从而充分地增大了蛋白质、多肽和四环素与十八烷基固定相间的分配因子(在溶质和蚀刻柱内壁上的有机部分之间)。 用有机物蚀刻毛细管的方法是以硅烷化一氢化硅烷化反应为基础的，在这个过程中，毛细管中被蚀刻过的表面先同三乙氧基甲硅烷反应，以产生一个氢化物表面，在理想的条件下，，一单层三乙氧基甲硅烷被沉淀在柱子表面，以致大部分硅烷醇被氢化物取代，然后通过注入一种含有烯烃的溶剂和一种适合的催化剂，如六氯铂酸，让其流过毛细管，有机成分就立即被附在氢化物上，这个过程被称作氢化硅烷化过程，在前面的研究中，被使用的烯烃为1-十八烯烃，硅烷化-氢化硅烷化反应方法也被用于毛细管电泳中未蚀刻的毛细管柱，以涂附丙烯酰胺聚合物。键合方法的一个好处是在有机部分和表面间形成了一稳定的硅一碳键合层。实验证明聚合丙烯酰胺毛细管通过氢化物间接键合比有机硅烷化更稳定，在这个研究中，被蚀刻的毛细管首先被氢化物介质键合，随后和7-辛烯基-1，2-二醇(7-OD)或1-十八烯烃反应，以产生适合于电色谱的柱子，在HPLC中 7-0D 键合材料已经表现出了比二醇基更小的疏水性，以致在用毛细管电色谱分离混合物产生更适合的特性，在这些混合物中，，一个适合的介于疏水性和亲水性间的平衡是必不可少的，例如生物分子。 2. 实验过过程料 2.1 材 溶菌酶(火鸡和小鸡的蛋清)，细胞色素C(马和牛的心脏)，核糖核酸酶A((牛的胰脏)，myglobin 和血管紧张肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，从 Sigma 公司采购，缓冲液包括：330mM磷酸盐，PH为2.14 (Fischer Scientific )；；19mM Tris 试剂 ( Sigma ) ；30mM柠檬酸，PH 为 3.0 ( Sigma )：25mM-氨基丙酸( Sigma ) ；30mM乙酸， PH为4.41 ( Aldrich， Milwaukee， WI， USA ) 和30mMY-氨基丁酸( Sigma))，去离子水从一台 Milli-Q 水纯化系统获得( Millipore， Bedford， MA，USA )，然后通过一层0.2um 的尼龙66薄膜过滤器过滤( Alltech Assoc.， Deerfield， IL， USA)，用于蚀刻毛细管的二氢氟化铵，购自 Aldrich 公司；三乙氧基甲硅烷、11-十八烯烃、7-0D和六氯铂酸(催化剂)、用于蚀刻柱后序改性的物质，也购自 Aldrich， 使用的毛细管为外径375um、内径 50um (Polymicro Technologies，Phoenix，AI，USA )。 2.2 仪 器 CEC和HPCE的实验均使用 PE 公司提供的型号为270A-HT系统 (Applied， Biosystems， Foster city，CA，USA)， 用于蚀刻和改性的炉子是一台 HP 公司的型号为5890的气相色谱，进口和出口因要与毛细管相|一致而更改。 2.3 细 管 的 制 备 毛细管表面氨处理、、.二氟化氢铵的蚀刻、氢化物介质的制备、氢化硅烷化反应以及毛细管内壁涂附期望的有机部分等过程均在前面已描述过。 2.4 电 色 谱普过程： 二醇基和十八烷基毛细管柱先进行预处理，由注射泵注入十倍柱体积的缓冲溶剂通过柱子，流动相要先经过超声波脱气处理，然后用用气清洁。电动进样在5KV电压下，，6秒完毕，所有样品均在211nm下检测。 3. 结 果 和 讨 论 在扫描电子显微镜的观察下，实验证明通过控制蚀刻过程的温度和时间，可改变熔融硅胶管内表面 的粗糙度。一种简单的观察蚀刻过程的方法可通过普通的光学显微镜获得，空管柱的内表面非常光滑。通过在300℃下用二氟化氢铵蚀刻了3小时后，毛细管内壁明显地粗糙了。新的表面的机械稳定性通过30分钟强烈振动后，大多数蚀刻过程中形成的粗糙表面已被破坏，仅有很少的部分在光学显微图片上能够看见，但这并不等于说内表面如同空管柱一样光滑，而仅仅表明在蚀刻过程中产生的长的辐射状硅胶已被机械振动破坏。一些在C18改性蚀刻柱上的CEC分 图1 离蛋白质和四环素的基本数据已给 出，如同在HPLC上，使用二醇基固定相会比典型的烷基键合相具有更大的亲水性，比如C18或C8。图1显示了一些基本的蛋白质在 PH 为4.41的缓冲溶剂、二醇基柱条件下的分离特征，峰是对称的，表明了在蚀刻过和改性过的柱表面只有很少少没有溶质的吸收。类似于前面说过的C18 柱，柱效基本在3万一6万理论塔板数/米，低于 HPCE， 这也符合了CEC方式中使用溶质一键合相间的吸附反应现象。另一个用二醇基柱分离的样品是牛和马的细胞色素c的分离，两种蛋白质的一百零四个氨基酸序列中仅仅只有三个氨基酸不同，在如图1所示的条件下分离因子(a=马的细胞色素c的保留时间/牛的细胞色素c的保留时间)为1.09。，这表明了二醇基蚀刻柱可为CEC分离提供不同的方式或溶质一键合相间不同反应程度。 图2 图2显示了一个有价值的用空管柱、二醇基改性柱和C18改性柱分离一系列的血管紧张肽的分离图谱的对比。对每根柱子，洗脱次序是相同的：血管紧张肽Ⅲ、血管紧张肽Ⅰ、血管紧张肽Ⅱ，结果表明了虽然溶质一键合相反应作用是重要的，电渗流是导致血管紧张肽分离的主要原因，既然三种成分混合物的分离是在三种等长度柱子相同的条件下，相对应的保留(洗脱)时间则反映了溶质移动和可能的k'值的外加观察现象。在图2中，每种溶质的保留时间按照以下的顺序： C18>二醇基>裸柱，在C18柱上长的保留时间可能由于被键合了高效的有机部分，也就是说，每个单位面面上被键合的颗粒数量多，或者更强的溶质贡键合相间的作用力，前者的可能性较小，由于十八烷基配位体明显地比 7-OD 颗粒大，一般来讲，更小的有机颗粒应该有更多的键合数量，至少在多孔的硅胶上是这样的，在C18柱上观察到的更宽的峰支持了后一种说法，这可能由于在被键合的 C18颗粒和溶剂间亲水作用导致了更大的吸附作用，因此有了更长的保留时间。 由于带电的溶质(如血管紧张肽)有电渗流来推动它们通过柱子，当加电压后，某些不保留和不带电的溶质建立在k'值基础上的保留图谱不可能是平直的，另一种方法是观察在三种不同柱子的各对溶质间分离因子(α=后洗脱出的成分的保留时间/先洗脱出成分的保留时间)，表1列出了在图示的条件下三个α值的比较，对于空管柱，分离仅仅由电渗流的不同来决定。然而，对于两种改性蚀刻柱，分离不仅由电渗流不同，还由溶质一键合相间反应作用来决定，由于在蚀刻柱表面的键合的配位 体数量不可能量化，，二醇基和C18柱的分离能力的不同可能由于它们的疏水性不同，也可能是由在内壁键合的数量不同，很明显的是，如果分离仅仅是由于电渗流不同，在相同的给定分离条件下，每一对溶质的α值将在三根柱子上是相同的。 表 血管紧张肽在不同柱子上的分离因子* 分离因子 空管柱 二醇基柱 C18柱 I/ 1.03 1.08 1.12 a / I 1.12 1.60 2.25 1.15 1.73 2.52 *PH=2.14，30KV， L=45cm， I=25cm. 表2 不同电压和 PH值条件下空管柱分离血管紧张肽的分离因子 PH值 电压(KV) 20 25 30 2.14 1.16 1.15 1.15 3.00 1.31 1.31 1.31 4.41 1.48 1.48 1.48 表3 不同电压和 PH 值条件下二醇基柱分离 血管紧张肽的分离因子 分离因子 电压(KV) 20 25 30 PH=3.0 1I/Ⅲ 1.10 1.10 1.10 Ⅱ/I 1.16 1.16 1.16 Ⅱ/Ⅲ 1.28 1.28 1.28 PH=2.14 aI II 1.05 1.06 1.08 /I 1.30 1.45 1.60 /Ⅲ 1.36 1.54 1.73 表2和表3中的数据更明显地显示了键合有机成分的作用。在表2中给出了在空管柱、几种的电压和PH值条件下的α值。在一种PH值下，电压改变，而分离因子不变。既然分离仅仅依赖电渗流的不同，而与所提供的电压无关，这一现象正是所预期的，因为溶质在 PH变化的条件下(电荷和/或结构)，一些α值的变化是可以观察到的，也是可以预见的，表3列出了在二醇基柱条件下的一些类似的比较，可以看到，在PH值为2.14时，电压的变化引起三种不同溶质对的α值的变化，在PH为3.0时，我们观察到了一个有趣的现象，a值与电压无关，很明显，对这些溶质来说，在高的 PH值条件下，溶质一键合相间的作用是可以忽略的，因为在空管柱中，分离主要是电渗流决定的。 图3 空管柱、二醇基柱和C18柱之间的不同可以通过观察在不同的实验条件下，火鸡和小鸡的溶菌酶的 分离来更好地说明，在PH值为2.4和30KV的电压条件下，空管柱和二醇基柱均不能分离这些溶质，然而在C18柱条件下(图3A)，色谱图给出这两种溶质的基线分离，和另一种附加成分(可能是一种样品的杂质)可明显地观察到它位于第二个峰的肩部，通过提高 PH到3.0、降低电压到25KV，裸柱和C18(图3B)给出两种溶菌酶的基本可识别的分离图谱和少量杂质的峰。然而。二醇基改性柱在这条件下，没有观察到任何变化。如果 PH 升到4.41，那么空管柱和二醇基柱(图3C)大约给出了相同的这两种溶菌酶的分离图谱，在这种条件下，很明显，色谱图上，次要成分可能有些移动，以致它在两个主峰之间洗脱出。相比空管柱，在二醇基柱上，它更清楚地作为火鸡溶菌酶峰的·个峰肩。相同条件下， C18改性柱上，两种溶菌酶未分离开，在C18柱上观察到的很宽的峰和峰拖尾表明了键合有机成分过强的吸附作用和残余硅烷醇的吸附作用。由于溶菌酶是很简单的蛋白质，它对可接触的 Si-OH 基团非常敏感，因此后一种可能性更大一 4. 结 论： 这个研究的结果证实了先前的两个关于在化学改性蚀刻柱上溶质一键合相作用的研究，，它不同于传统方法，是电色谱的另一种方式，原因在于它以开口管结构代替了填充柱，实验的结果表明了键合蚀刻柱同空管柱相比具有明显不同的保留特性，另外，不同的有机成分涂附在蚀刻过的表面，分离的能力也会不同，如同HPLC中依赖不同的化学键合配位体一样，这种方式的电色谱的另一些基本特性以及各种各样化学改性蚀刻柱制作的进一步研究正在取得进展。