玉米种子中纯度检测方案(凝胶成像系统)

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安徽农业科学，Journal of Anhui Agri .Sa .2006 ，34(11)：2344-2345责任编辑 庆瑢 责任校对 庆瑢 孟超敏等盐溶蛋白电泳检测玉米种子纯度的操作技术34 卷11 期2345 盐溶蛋白电泳检测玉米种子纯度的操作技术 孟超敏，郑跃进，姬俊华，马占强，刘素云，张念辉 (1.河南科技大学农学院，河南洛阳471003；2.洛阳大学环境与化学工程学院，河南洛阳471023；3.河南省汝阳县种子公司，河南汝阳471200) 摘要 介绍了玉米种子盐溶蛋白电泳鉴定真伪及纯度的操作技术，并对该方法在实际应用中应参照的国标及存在的问题进行了分析和探讨。 关键词 玉米；电泳；品种纯度；操作技术 中图分类号 S513 文献标识码B 文章编号号0517-6611(2006)11-2344-02 Probe into the Key Technique and Probens in Idertification of Variety Purity and Authenticity MENG Chao- nin et al ( Agricultural College， Henan Uiversity of Scence and Technology ，Luoyang ，Henan 471003) AbstractIn this paper， the key techni ques in the procedure of naize seed salt- soluble protein electrophoresis were clarified. The problemin the actualappraisal work were anal yzed and discussed. 品种纯度是种子质量的重要指标，品种纯度鉴定是种子生产工作中不可缺少的重要环节。目前，品种纯度检测方法有很多，主要有田间种植鉴定和室内检测州。在诸多室内检测方法中，电泳法是较为常用的方法23，是近几年国际种子检验协会(ISTA) 推荐的几种比较可靠的方法之一4，全国农技服务中心组织全国11个省的质检机构连续3年的联合攻关研究和完善，制订了玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定法(NY/ Y449-2001)，该方法的制订与实施，填补了我国自行研制种子生化测纯标准方法的空白，为我国玉米种子室内纯度鉴定提供了重要手段3.5。因此在农科高年级学生专业实验课中开设品种纯度电泳鉴定的操作实验非常必要。笔者介绍该方法在实验中的操作技术，并分析在实际应用中存在的问题。 1 操作技术[5，6] 1.1 溶液配制 1.1.1 准备好合格的药品。所用化学试剂应为分析纯或合格的化学纯，盐溶蛋白电泳法属生化方法，需用化学试剂15种配置多种操作溶液，要注意化学试剂的纯度和质量，还要注意个别试剂容易失效变质。如硫酸亚铁和抗坏血酸都是还原性试剂，若放置时间过长或密封不好，很容易被氧化变质，失去对凝胶的催化作用，导致凝胶不凝固或凝胶效果不好；过氧化氢是凝胶形成的引发剂，它容易在高温或光照下分解而变质；乳酸钠和乳酸溶液在高温下受到微生物的作用而变质沉淀；凝胶溶液会在光照下发生聚合。因此，购买试剂时应注意其产地、厂家、生产日期和密封情况。配制好的溶液应装在棕色瓶中放冰箱低温保存，凝胶液应在14d内使用，其他溶液可以保存60d。 1.1.2严格按配方配置溶液。在配置溶液时，应做到称量准确。在称取极少量试剂(如；硫酸亚铁)时，可采用加倍称取，稀释取用的方法，以减少称量误差；在用酸度计调节浓缩胶缓冲液的pH值时，可用乳酸原液经稀释后再调节的方法更为有效。 ( 基金项目 河南科技大学实验基金项目(SY0405047) 和人才科学研究 基金项目(04055)。 ) ( 作者简介 孟超敏(1977-)，男，陕西咸阳人，硕士，讲师，从事种子与 生物技术育种的教学及科研工作。 ) ( 收稿日期 2006-03-07 ) 1.2 样品制备 1.2.1 磨碎过程要仔细。样品磨碎时要注意，单粒样品磨碎器要清理干净，如果用钳子代替单粒粉碎机粉碎种子时，应垫上小片清洁的布或纸，防止交叉污染。磨碎时要特别注意不能有样品散失，尤其是胚部不能丢失，因为胚部含油分较高，在样品含水量高时，粉碎后的样品容易粘在单粒粉碎机或白布上，这时一定要将其清理下来并与其他部分一起放入离心管中。如果样品的水分高，可在40℃烘箱中烘干1~2h，使水分达标后再进行粉碎。同时每粒种子粉碎的程度或细度应基本一致，以保证各管样品提取蛋白质含量基本一致。 1.2.2 加入提取液要适量。单粒样品均匀粉碎后，在加入提取液时，应注意尽量加入与样品同体积的量，特别是小种子，如加入与大种子同量的提取液，则蛋白质浓度低，影响电泳质量，谱带色淡，易错判。 1.3 电泳操作 1.3.1 胶室要清洗干净。电泳凝胶是在两块玻璃板组成的胶室中形成的，灌胶前要求将玻璃板充分洗净、擦干，否则会使封胶时部分胶和电泳槽或玻璃板粘合不紧，留有缝隙而漏胶，或使电泳凝胶会沾在玻璃板上难以剥离。因此，清洗玻璃板时首先要用软毛刷把板上的凝胶清除干净，避免划破玻璃板，然后用海面等软的物品清洗，清洗干净后用蒸馏水冲洗两面，垂直放在玻璃板架上自然晾干。 1.3.2 凝胶配制应严格配比、均匀一致。凝胶各成分配比要准确，特别是加入引发剂过氧化氢的量应准确。若加的量过多会使胶凝速度太快，导致凝胶孔径不匀，影响电泳结果；加的过少，凝胶形成过慢，甚至不凝，造成封底不严而漏胶。过氧化氢加入后要迅速摇匀，保证胶液均匀一致，否则会使形成的凝胶孔径不匀，造成谱带弯曲而变形，给谱带鉴定带来困难。 1.3.3 注意根据凝胶质量判定凝胶是否失效。在灌分离胶时，有时会遇到凝胶液从玻璃板底部外漏的情况，这说明底缝未封好，其原因可能是凝胶溶液中个别试剂失效或部分失效，应通过检查凝胶液凝固的速度和凝胶强度，决定是否重新配置凝胶液。如果发现凝胶析出大量的水，凝胶强度变软，定是溶液中硫酸亚铁或抗坏血酸或过氧化氢部分 失效，应重新配制凝胶溶液，否则影响谱带的分辨率。 1.3.4 认真接通电源，控制好温度。电泳前应看好正负极的接口，前槽接正极，后槽接负极，然后打开电源，逐渐将电压调到500V。在电泳过程中，两端电极由于发生激烈的氧化还原反应而产生大量的热，使凝胶温度升高，蛋白质扩散作用增大，谱带变宽，降低了方法的分辨率。因此，电泳温度应保持在15~20℃，当室内气温过高时，应放在冰箱内、空调室或接通自来水等措施冷却，以防蛋白变质而影响电泳图谱的质量。 2 应用分析 2.1 计算与判定标准 农业部于2001年制定了玉米盐溶蛋白电泳鉴定方法的行业标准(NY/T449-2001)，并于2001年11月1日开始实施。该标准规定玉米电泳检测值代入回归方程(Y=52.9+0.461 X，其中Y为检测的最终结果，X为电泳检测值计算后作为电泳检测的最终结果，以国家种子质量标准 GB4404.1-1996，判定被检样品是否合格。国家种子质量标准 GB4404 .1-1996 中规定，玉米单交种一级纯度不低于98.0%，二级不低于96.0%；玉米自交系原种纯度不低于98.0%，良种纯度不低于99.0%7 2.2 问题及处理方法8 2.2.1 电泳测定值与田间值存在差异。电泳测定值是根据电泳谱带差别谱带多少、有无、染色深浅等鉴定出不同品种类型，然后计算样品的纯度，这个数值和田间种植结果肯定存在一定差异。将室内测定的电泳值和田间小区种植鉴定出来的纯度值进行相关分析，推出回归方程，由此计算出来的样品纯度值很难达到十分准确的程度。假如检测某个玉米品种种子的室内电泳测定值为零，代入回归方程，Y值样品田间纯度值还能达到52.9%，这个结果显然不合理，电泳检测值与检测结果有很大的差距。电泳检测值越小，检测结果与电泳检测值之间相差越大，当电泳检测值达到90%以上时，电泳检测结果与检测值之间的差距很小，所以要根据实际情况，再选用这个回归方程推测出来的数值和国家农作物种子质量标准( GB4404.1-1996)相比较，综合判断种子质量是否合格。 2.2.2 蛋白表达存在差异。盐溶蛋白电泳方法是通过不 同玉米品种在蛋白谱带的差异来鉴别，而蛋白的表达则是基因控制的，由于我国玉米品种遗传基础狭窄，部分亲本基因型相近或相同，反映到蛋白表达上差异不明显，有些品种很难通过蛋白鉴定法进行鉴别。其次有些亲本主要是在已有杂交种基础上选育出来的多环系，遗传基础复杂，在自交后代中不断分离，致使蛋白表达不稳定，无规律，反映到蛋白电泳图谱上，谱带多、乱、杂，难以鉴定。 3 小结 品种纯度鉴定是种子科学专业实验中的重要项目。种子纯度和真实性的检测技术，已由传统的形态方法发展到以检测蛋白质和DNA 多态性的分子水平，其方法由简单到复杂，结果也更加精确。每种方法都有自身的优缺点，至今，还没有一种方法能够完全准确、快速、经济地进行种子纯度检验。因此在应用时，要根据实际情况，将传统的形态鉴定法、现代生化方法和分子标记技术相结合，充分发挥综合技术优势，达到准确、经济、快速的目的。 利用盐溶蛋白电泳技术鉴定杂交玉米种子纯度具有分离效果好、分辨能力高、稳定性好、快速简便的特点，与种植鉴定相比，大大缩短了杂交玉米种子纯度鉴定的时间，深受各制种、售种单位的欢迎，具有一定的使用价值。应用该项检测方法除了掌握技术环节外，还要根据实验的原理和实际情况，不断总结摸索，以获得理想的结果。 ( 参考文献 ) ( [1]支巨振.农作物种子检验规程实施指南M.北京：中国标准出版社， 2000：52-100. ) ( [2] 支巨振，毕辛华，杜克敏，等.农作物种子检验规程真实性和品种纯度 鉴定M.北京：中国标准出版社，1995：10-13. ) ( [3] 辛景树，赵建宗，丁万志，等.玉米种子纯度盐溶蛋白电泳法M.北京： 中国标准出版社，2001：1-3. ) ( [4] ISIA. Anendnert to internationd rules for seed testing[ M . Zurich： ISTA Hress ， 1996. ) ( [5] 滕开琼，戴钢，徐立新，等.电泳技术在种子纯度鉴定中的几个关键问 题』.河南农业科学，2004(10)：24-26. ) ( [6] 万普林.玉米种子盐溶蛋白电泳技术反应条件的优化组合】.现代农 业科技，2005(5)：18. ) ( [7] 李仁凤，任淑萍，邓荫金，等.粮食类作物种子一禾谷类M.北京：中国 标准出版社，1996：2-5. ) ( [8] 王婷，张进生，戴钢，等.电泳检测小麦、玉米种子纯度存在的问题探析 [J.河南农业科学，2005( 12)：41-42. )