鱼料中氨基酸检测方案(氨基酸分析仪)

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440nm600 Biochrom30+氨基酸分析仪氧化水解法检测鱼料中氨基酸 样品前处理 1、 所用试剂 1、1 浓盐酸，，优级纯 1、2 6mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合 1、：3 水：：.去离子水 1、44 苯酚：须重蒸 1、5 19种氨基酸标准品 行号 氨基酸 行号 氨基酸 1 Tau 牛磺酸 2 Asp 天冬氨酸 3 Thr 苏氨酸 4 Ser 丝氨酸 5 Glu 谷氨酸 6 Pro 脯氨酸 7 Gly 甘氨酸 8 Ala 丙氨酸 9 Cys 胱氨酸 10 Val 缬氨酸 11 Met 蛋氨酸 12 lle 异亮氨酸 13 Leu 亮氨酸 14 Nle 正亮氨酸 15 Tyr 酪氨酸 16 Phe 苯丙氨酸 17 His 组氨酸 18 lys 赖氨酸 19 Arg 精氨酸 20 2、 标样配置 氨基酸混合标准储备液：含有天冬氨酸、苏氨酸等17种常见组成蛋白质的氨基酸。 牛磺酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成 2.5umol/L的储备液备用。 正亮氨酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成2.5umol/L的储备液备用。 璜基丙氨酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成 2.5umol/L的储备液备用。 蛋氨酸砜标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成 2.5umol/L的储备液备用。 羟脯氨酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成 2.5umol/L的储备液备用。 鸟氨酸标准储备液：用PH2.2的柠檬酸缓冲液配置成2.5umol/L的储备液备用。 将17种氨基酸混合标准储备液、牛磺酸、正亮氨酸、璜基丙氨酸、蛋氨酸砜、羟脯氨酸、鸟氨酸及 PH2.2的柠檬酸缓冲液按照1：1：1：1：1：1：1：3配置成0.25umol/L的标准品 待用。 3、 前处理设备 1) 天平 2) 水解管 3) 量筒 4 无油真空泵 5) 干浴水解、浓缩仪 6) 移液管 7 0.45um 滤膜 4、 样品制备(参考欧盟饲料指令 98/64/EC) 1、 样品的准备 粉碎样品，通过 0.5mm 的筛孔。高水分的样品粉碎前必须低于50℃鼓风干燥或者冷冻干燥。高脂肪含量的样品粉碎前必须用轻用石油(3.12)脱脂。 2、 氧化 从准备好的样品中品取约0.1~1克样品，准确到 0.2mg，于100 ml带螺纹盖子的瓶子中，称取的样品应该含有大约 10mg氮，水分不能超过 100mg。将瓶子放于冰水浴中冷却至0℃，加5ml氧化试剂(过甲酸苯酚)，用带弯头的玻璃刮勺混合。用空气密封膜将瓶子和刮勺一起密封，密封后一起放入0℃冰箱的冰水浴中，放置16小时。之后，从冰箱中取出，加0.84克偏重亚硫酸钠(3.4)来分解过量的氧化试剂。 3、 水解 加入25毫升盐酸-苯酚溶液，然后将反应瓶放在烘箱中，温度控制在110摄氏度，旋松帽子(防止玻璃瓶子破裂)，水解1小时。然后快速旋紧瓶塞(戴手套和护眼罩)将其继续在烘箱110摄氏度下水解23小时。 4、 加入内标并且调节 pH值到2.20 当水解反应结束后，将反应瓶从烘箱中取出，并且打开瓶口(戴手套和护目镜)。冷却后用定量加样器准确加入 15.00 克(15毫升)正亮氨酸标准溶液，混合并且转移水解溶液到250毫升的塑料烧杯中。加入大约125毫升柠檬酸缓冲液和19毫升氢氧化钠水溶液，将实验烧杯放入到样品容器中用氢氧化钠水溶液将溶液调 节到pH为正好2.20。 转移一部分溶液(不需要全部)到50毫升有盖子的塑料瓶中。可以马上测定或者放入冰箱等到分析的时候测定。 分析方法描述 (Biochrom 30+) 氨基酸分析仪分析方法参数： 1)色谱柱： Biochrom Na 型阳离子交换树脂柱， 4.6x20cm 2)分离程序： NO. Time lemp Buffer Pump Nin Rec Commands 1 01：00 53 3 35.0ml/h ON OFF 2 00：00 53 3 35.0ml/h 1ON OFF Reset 3 03：30 53 3 35.0ml/h ON OFF Load 4 15：45 53 1 35.0ml/h ON ON 5 12：00 58 2 35.0ml/h ON ON 6 02：00 58 4 35.0ml/h 1ON ON 7 26：00 92 4 35.0ml/h ON ON 8 04：00 92 6 35.0ml/h ON ON 9 04：00 92 3 35.0ml/h ON ON 10 14：00 53 3 40.0ml/h OFF OFF 11 02：45 53 3 35.0ml/h ON OFF End 3))运行时间：分析时间 65min 4)反应单元温度：135℃。 5)检测波长：570nm、440nm同时检测。 三、 外标法定量 1)19种氨基酸标准品谱图 570nm Minutes 2))进标样，拟合校正曲线，使用外标法软件自动算出每个氨基酸的含量。 3)样品中含量的计算公式 样品和标准品中单个氨基酸的峰面积与总氨基酸量的峰面积，计算表示为：每1kg样品中含有氨基酸g数。 AxExMW×Fg氨基酸/kg 样品： BxWx1000 D如果使用内控标准，需要乘以C A――水解液或萃取液的峰面积 B―校准标准液的峰面积 C――水解液或萃取液中内控标准的峰面积 D--标准校准液中内控标准的峰面积 MW--被测定氨基酸的分子量 E――标准的浓度，u mol/ml W―-样品重量(干燥和脱脂的样品要换算成原始重量) F―-水解液(5.3.4)或萃取液(6.1)稀释后的体积 胱氨酸和半胱氨酸在氧化水解液中以磺基丙氨酸的形式来测定的，但是计算时应转化为胱氨酸计。(分子量由240.30改为 120.15) 蛋氨酸在氧化水解液中以蛋氨酸砜的形式来测定的，但是计算时应转化为蛋氨酸计。分子量为149.21。 附、鱼料分析图谱及做样结果 600 Blo 30+ 570nm Retention Time Name 500- 500 I 400 Name der AS Time [Min] Area Average RF AS-Gehalt in (%) o寸飞厂 OOO IOO OO CYS-OX 2.187 2.481 190435466 3.25 46949884 1.13486 0.483 TAU 4.92 36184970 0.76077 0.555 HYP# 0.000 BDL MET-SO2 15.88 79056809 0.90713 1.017 ASP 17.37 319875285 0.92100 4.052 THR 19.35 150336713 1.02800 1.706 SER 20.63 184662803 1.22500 1.759 GLU 23.48 533384697 0.90987 6.840 PRO# 24.63 11574091 0.06176 GLY 27.20 401108224 1.88613 ALA 28.38 283901333 1.35875 2.438 VAL 30.12 1.08000 2.057 MET# 30.58 1998366 0.93290 0.025 ILE 32.88 142702203 0.92128 1.807 LEU 33.77 285504572 1.05664 3.153 NLE 34.83 371833764 1.00000 4.338 TYR# 37.27 85086233 0.75663 1.312 PHE 38.70 137110164 0.83641 1.913 GABA# 0.000 BDL HIS 48.95 102457565 0.95137 1.257 HLYS# 0.000 BDL ORN 0.000 BDL LYS 54.52 250246543 1.02800 2.840 NH3 56.55 299022752 4.26112 0.819 ARG 63.48 189129327 0.78500 2.811 Bio 30+440nm Results Name der AS Time [Min] Area Average RF HYP# 14.28 4155469 1.20000 0.209 GLU 23.48 200862067 1.85113 6.539 PRO# 24.65 79484004 2.35000 2.038 GLY 27.22 76664029 1.86575 2.476 ALA 28.40 52688963 1.34037 2.369 NLE 34.85 71993176 1.00000 4.338