肉制品中沙门氏菌检测方案

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热带医学杂志2010年8月第10卷第8期·935··基础研究论著· Journal of Tropical Medicine Vol.10 No.8 Aug. 2010·936· [文章编号] 1672-3619(2010)08-0935-02 间接免疫荧光检测技术检测沙门菌的实验研究 黄愈玲1，李少彤2，龚玉姣 (1.广州市疾病预防控制中心，广州510080： 2.广州市海珠区疾病预防控制中心，广州510288) 【摘要】 目的 为加强食品安全管理，快速检测食源性致病菌，对间接免疫荧光检测法检测沙门菌的敏感性进行探讨。方法 制备沙门菌抗原片和食品样品抗原片，用沙门菌A-F多价诊断血清作为一抗，异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔 IgG 作为二抗。结果 与国标法比较，沙门菌间接免疫荧光法具有快速、简便等优点，且两种检验方法的阳性检出检未出现统计学差异(P=0.250)。结论 沙门菌间接免疫荧光检测法可以用于食品安全快速检测。 【关键词】 沙门菌；间接免疫荧光法；实验研究 中图分类号：R446.61 文献标识码：A Application of Indirect Immunofluorescent Assay for the Detection of Salmonella HUANG Yu-ling， LI Shao-tong， GONG Yu-jiao (Guangzhou Center for Disease Control and Prevention， Guangzhou 510080，China) 【Abstract】 Objective Develop indirect immunofluorescent technique for the rapid detection of Salmonella and tostrengthen the management of food safety. MethodsSalmonella antigens and antigens from food samples were preparedand coated on slides..Salmonella A-F diagnostic antisera was used as primary antibody and fluorescein isothiocyanate(FITC))conjugated sheep IgG was used as secondary antibody in the immunofluorescent assay.Results There was nostatistics significance between the developed indirect immunofluorescent assay and the National Standard Method (P=0.250).Compared with the National Standards Method， the indirect immunofluorescent assay were rapid and simple toperform.Conclusion The developed indirect immunofluorescent method may be used for the rapid detection offoodborne salmonella safety. 【Key words】 Salmonella； indirect immunofluorescent technique； experimental research 在世界各地的食品安全突发事件中，沙门菌引起的食源性疾病常占首位或第二位立，食物链中沙门菌污染及其造成的食源性疾病和潜在的健康危害更是普遍存在。如何快速筛查靶菌，关键依赖于相关卫生技术部门发展和应用快速检测技术[2-4]。本文对沙门菌间接免疫荧光检测技术进行了探讨，并与食品卫生微生物检验方法[51的检验结果进行比较。 1 材料与方法 1.1 样品来源 从超市中随机抽取冷冻食品5份，熟食制品5份。 ( 基金项目：广东省医学科研基金项目(No.A2 0 09576)；广州市医药 卫生科技项目(No. 2 008-YB-186)。 ) ( 作者简介：黄愈玲(1970-)，女，硕 士 ，主管技师，主要从事微生物检验和研究工作 。 ) 1.2 菌株、仪器与试剂 沙门菌 A-F多价诊断血清为宁波天润生物有限公司产品；沙门菌阳性菌株(包括肠炎、鼠伤寒、德尔卑、阿贡纳、猪霍乱、伤寒沙门菌)、副溶血性弧菌、温和气单胞菌、大肠埃希氏菌由中心实验室提供； 一抗为宁波天润生物有限公司生产的兔抗诊断血清((沙门菌 A-F多价诊断血清)；；二抗为异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC) 标记的羊抗兔 IgG，是北京盈信阳光生物技术有限公司产品；免疫增感液Solution Ⅰ和Ⅱ为北京盈信阳光生物技术有限公司产品；荧光显微镜采用日本 OLMPUSBX51TF 反射荧光显微镜(100W汞灯，激发光滤光片为450~490 nm，吸收滤光片为520 nm)。 1.3 应用间接免疫荧光法检测沙门菌的方法 1.3.1 样品的前增菌和增菌 对冷冻的样品先用缓冲蛋白胨水 BP 进行前增菌6h，使“受伤的”、冷冻的沙门菌复苏；使用亚硒酸盐盐氨酸 SC 进行增菌，使靶菌大量繁殖， 同时抑制其它杂菌生长。 1.3.2 沙门菌菌液的制备 在1瓶1000ml自来水中加入普通肉汤2ml，高压灭菌后，加入沙门菌(肠炎沙门菌)的新鲜培养物，使菌液浓度约为3×10CFU/ml，将菌液置4℃冰箱保存。 1.3.3 沙门菌抗原片的制备方法 取1ml沙门菌菌液，12 000 r/min，10 min 离心集去，弃去上清，使剩余量约为50 pl，取 20 pl膜到镀膜玻片上每个孔内，自然晾干，滴加4℃预泠的丙酮固定，待丙酮自然挥干后，过火焰2次加强固定。采用上述方法分别制备10份样品及其增菌液抗原片共20份、阴性对照抗原片(以副溶血性弧菌、温和气单胞菌、大肠埃希氏菌作为阴性对照)3份、在亚硒酸盐胱氨酸增菌液中分别添加沙门菌阳性菌株(鼠伤寒、德尔尔、阿贡纳、猪霍乱、伤寒沙门菌)的不同型别菌株抗原片，每株菌株平行制备抗原片3份共15份。 1.3.4 一抗和二抗的制备 取沙门菌A-F多价诊断血清，用生理盐水溶解后等效价混合，然后用免疫增感液Solution I稀释至两者最终效冬均为1：30、1：60、1：120、1：240后备用。再取 FITC 标记的羊抗兔IgG，分别用免疫增感液 SolutionⅡ稀释10、20、30、40倍备用。 1.3.5 结果观察与判定 将全部的抗原片进行间接免疫荧光抗体染色，晾干后于荧光显微镜观察结果。用油镜观察，镜下可见背景为黑色，呈绿色荧光的菌体的图像为阳性结果；无特异性荧光者为阴性结果。在进行间接免疫荧光检测的同时，对样品和样品增菌液和沙门菌不同菌株抗原片的菌液(共35份)同时进行国标法的培养、分离和鉴定，比较这两种检验方法检测沙门菌阳性率的差异。 1.4 统计分析 采用 SPSS11.0软件进行数据的统计分析，沙门菌的阳性率比较采用卡方检验。 2 结果 2.1 一抗和二抗浓度的优化及确定 分别使用最终效价均为1：40、1：80、1：160、1：320的一抗和稀释1：5、1：10、1：20、1：40倍的二抗对同一批次制备的沙门菌抗原片及同一批次制备的阴性对照抗原片分别进行间接免疫荧光试验(设定一抗、二抗的结合时间均为30 min)， 观察一抗和二抗的浓度对特异性荧光和非特异性荧光强度的影响。结果显示一抗效价定为1：60，二抗的稀释倍数定为1：30的效果最佳。 2.2 间接免疫荧光染色时间的优化 在确定抗体浓度的同时，比较一抗与抗原结合以及荧光素标记的羊抗兔 IgG 抗体与抗抗体结合时间对检测结果的影响。最佳时间是一抗与抗原结合的时间及二抗与一抗结合的时间均为30 min。 2.3 间接免疫荧光法检测的结果 采用上述确定的条件，对样品和样品增菌液、沙门菌不同菌株抗原、阴性和阳性对照抗原片进行染色。镜下可见背景为黑色，呈绿色荧光的菌体的图像为阳性结果；无特 异性荧光者说明没有被染色，为阴性结果。 2.4 用国标法和间接免疫荧光法检测的结果 应用国标法检测20份样品液及其增菌液，均未检出沙门菌，15份沙门菌不同菌株抗原片的菌液均检出对应型别的沙门菌；而应用间接免疫荧光法检测的20份样品及其增菌液抗原片、3份不同菌株抗原片均未见呈绿色荧光的菌体图像，为阴性结果。其余12份不同菌株抗原片均可见呈绿色荧光的菌体图像，为阳性结果。应用国标法和间接免疫荧光法检测沙门菌的检测情况详见表1，检测沙门菌阳性率的差异见表2。结果显示，间接免疫荧光法和国标法检出沙门菌的阳性率的差异无统计学意义(P=0.250)。 表1 间接免疫荧光法和国标法检测沙门菌的检测情况 Tab.1 The results of detection on Salmonella by nationalstandards method and indirect immunofluorescent assay 抗原片名称 数量 间接免疫荧光法 国标法检出 (份) 检出阳性数(份) 阳性数(份) 食品样品液 10 0 0 样品增菌液 10 0 0 不同型别沙门菌菌株 15 12 15 合计 35 12 15 表2间接免疫荧光法和国标法检测沙门菌结果比较 Tab.2 Comparison of the results for detection on Salmonella between national standards method and indirectimmunofluorescent assay 国标法 合计 间接免疫荧光法 + 一 十 12 0 12 一 3 20 23 合计 15 20 35 3 讨论 目前沙门菌的检测仍以国标法为主，包括样品的增菌、靶菌的分离、培养、革兰氏染色镜检、生化反应鉴定和血清学分型鉴定等。其优点是特异性强，缺点是检测时间长，鉴定可疑菌株大约要3~5 d，生化反应分型至少也要求观察3~14d，有时还要借助噬菌体裂解试验来排除疑似菌株，要求检验人员要有丰富的工作经验。 间接免疫荧光法既可以检测抗体，也可以检测抗原(可以同时检测几种混合抗原)，所需设备不需复杂仪器，实验过程简单、易操作，判断结果简单、易解释，具有快速、准确、特异、敏感等优点[6-9]。利用间接免疫荧光检测法可对大批量的样品进行沙门菌属抗原阳性初筛，抗原片阳性者可利用样品液以常规方法进行分离培养，可快速排查可疑致病菌，大大节省实验时间。若将两种方法的结果结合起来判断，则更能对该类样品中沙门菌的数量、存活状况和种类进行动态的了解和评估。因此将其应用于食物中毒突发事件的快速诊断及大量样品的筛选，(下转第941页) ( [ 2 ] 丛玉隆.血液学体液学检验与临床释疑[M].北京：人民军医 出版社，2004：294-298. ) ( [3] 彭黎明，李丽娟，彭志勇 ， 等.几种血细胞分析仪结果的比对和质控[J]. 中 华检验医学杂志，2000，23(2)：94-97. ) ( [ 4 ] 彭明婷，谷小林.不同方法校准血液分析仪结果的比较[J]. 中华医学检验杂志，2000，23(1)：35-37. ) ( [ 5 ] O'Sullivan M B.Qulity c ontrol o f m ultichannel haematology analysers ：critique of fcurrent n methods s and the need f or performance goals[J] . 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