胶体金免疫电镜技术中应用检测方案

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·373·内蒙古医学院学报 2007年10月 第29卷 第5期 ·374·Acta Acad M ed NeiMongolOct 2007 Vol 29 Na 5 综 述· 胶体金免疫电镜技术及其应用 萨仁高娃： 其木格”.，吴 岩.* (1.内蒙古医学院组织胚胎学教研室，内蒙古呼和浩特010059；2电镜中心) 摘 要：免疫胶体金技术是继三大标记技术后对免疫标记技术的又一大贡献，近年来发展迅速，应用范围较广。胶体金免疫电镜技术是研究细菌、病毒、肿瘤和自身免疫疾病的主要方法之一。本文综述了胶体金免疫电镜技术的原理、特点、应用及研究进展。 关键词：胶体金免疫电镜技术；肿瘤；病毒 中图分类号：Q-336 文献标识码：A 文章编号：1004-2113(2007)05-0373-05 COLLO IDAL GOLD IMM UNOELECTRONMICRO SCOPY TECHNIQUE AND ITS APPL ICATDN Sarengaowa， Qmuge， WU Yan (D eparm ent of Histology and Em bryology，InnerM ongolia M edical College， Hohhot 010059 China) Abstract： mmune colloidal gold technique has great contribution to immunolabelling technique，which develop s quickly and app lies comp rehensively in recent years Colloidal gold immunoelection mi-cro scopy technique is one of studies on bacterium， principle， advantages and application virus， tumorand autoimmune diseasesThis paper summarized the development of research of the colloidal gold im-munoelectron micrscopy technique， principle， advantages and application The prospects of colloidalgold immunoelectron micr scopy technique were discussed in this paper Key words： colloidal gold immunoelectron m icro scopy technique； tumor， virus 20世纪人们将电镜技术与免疫学方法相结合，逐步形成了免疫电镜检查术。1971年， Faulk和 Taylor 首次用胶体金标记抗体，取得了较满意的结果。]1983年， Holgate等21加以改进，将免疫金染色与银显影技术相结合，建立了免疫金银染色法(immunogold silver staining， IGSS)。近年来，胶 体金标记技术得到进一步发展，已广泛应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金/银、斑点金免疫渗滤及免疫层析。胶体金标记抗体技术的引入无疑是免疫电镜发展过程中的又一个里程碑。 ( 收稿日期：2007-03-25 修回日期：2007-09-15 ) ( 基金项目：内蒙古自治区人才开发基金(2005)；内蒙古自治区自然科学基金 (200408020927) ) ( 作者简介：萨仁高娃(1981-)，女，蒙古族，内蒙古医学院2006级在读硕士研究生。 ) ( 通讯作者：吴岩，教授，博士，硕士研究生导师，E-mail： yanw007@sina com 内蒙古医学院组织胚胎学教研室010059 ) 1 免疫胶体金技术的基本原理及特点 胶体金是表面带负电荷的疏水性颗粒，颗粒之间的静电排斥力使它们在水溶液中保持溶胶状态。胶体金溶液呈红葡萄酒颜色，大颗粒胶体金溶液呈紫红色。氯金酸(HAuCl)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验 中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术 (mmunogold labelling tech-nique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性.在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒.当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。 免疫胶体金技术是继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术，与现有其它标记方法和标记物相比，有以下特点：(1)胶体金制备容易；(2)免疫胶体金对组织细胞的非特异性吸附作用小，几乎不出现非特异性吸附；(3)金颗粒大小可以控制，颗粒均匀，可进行双重和多重标记，即用不同大小的金颗粒分别标记不同的抗体，实现在同一张切片上观察两种以上的抗原，也可以和其他标记物配合进行双重或多重标记；(4)既可用于光镜，又可用于电镜；既可用于透射电镜，又可用于扫描电镜；(5)可以标记多种生物大分子物质，如抗体葡萄球菌蛋白A(SPA)、凝集素、多糖、多肽及其它蛋白质而不影响其生物活性；(6)由于胶体金本身有鲜艳的橘红色，可用光镜或肉眼观察实验结果，也可用分光光度计测定光吸收，进行定量分析。可在切片不同视野中根据金颗粒的数目来半定量抗原；(7)灵敏度高，染色简便，不影响原有超微结构的观察，显色结 果可长期保存。 2 免疫金探针的制备、纯化和鉴定 胶体金的制备一般采用化学还原法，可以方便地从氯金酸溶液中制备不同粒径(5~150mm)的胶体金颗粒。胶体金的粒径不同会呈现不同的颜色。常用的制备方法有白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、鞣酸-柠檬酸三钠还原法、乙醇超声波还原法和硼氢化钠还原法等。其中，以鞣酸-柠檬酸三钠还原法最为常用，它可根据需要制备出多种不同直径的胶体金颗粒，适用于多重标记。胶体金可用于标记许多生物大分子，如免疫球蛋白、卵白素、植物血凝素、脂蛋白、糖蛋白等。用胶体金可制备成不同的免疫金探针。免疫金探针通过超速离心法、凝胶过滤法或梯度离心进行纯化，可除去其中未结合的蛋白质、不稳定的胶体金和标记过程中形成的聚合物。免疫金探针可用于负染法检查，并用细胞化学染色试验对其生物活性进行鉴定。目前常用的免疫金探针有A蛋白胶体金、G蛋白胶体金免疫球蛋白胶体金、植物血凝素胶体金等。 3 胶体金免疫电镜技术的特点 胶体金免疫电镜技术与常规电镜技术有诸多不同，在标本的处理方面也有很多特殊的要求。 3.1 固定 理想的免疫电镜标本固定，既要保存组织的抗原，又要具有良好的细胞超微结构。对于多数抗原，按常规电镜技术固定标本会使其抗原性部分或完全消失。因此，免疫电镜常用一些特殊的固定液，如高碘酸盐--赖氨酸-多聚甲醛固定液(PLP)、4%多聚甲醛固定液、多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液(PG)及苦味酸-多聚甲醛固定液。在实际操作中发现，用 1%多聚甲醛加0.01%~0.05%的戊二醛最理想。此固定液不但配置简单，而且效果满意。而对于某些抗原性较强的标本，也可采用4%多聚甲醛加0.05%~0.5%的戊二醛固定. 3.2 包埋剂 包埋剂 Epon树脂可用于很多抗原包里后染色，它需要能使脆弱抗原变性的聚合温度，且黏度大，易吸潮，在一定程度上限制了其使用。 Spurr树脂黏度较低，不易吸潮，克服了Epon树脂的某些缺 点，但同样需要较高的聚合温度。近年来，水溶性包埋剂已逐渐应用于免疫电镜，如 Lowicryl K4MLR White，LR Gold等。这些包埋剂需要特殊的聚合条件，如 Lowicryl K4M 需在低温下脱水，渗透 .然后在-35℃以下用紫外光(波长315~360mm)聚合；LRGold需用蓝光在-25℃聚合。低温可以大大降低脱水剂和包埋剂对蛋白的失活和抽提作用，有利于保持抗原。但因价格较贵，聚合条件要求相对较高，不同程度地限制了水溶性包埋剂的应用。 3.3 免疫染色 免疫染色是免疫电镜技术中极为重要的一个步骤，其方法有包埋前染色，包埋后染色和不包埋染色三种。免疫反应在包埋前进行，然后再制成超薄切片，为包埋前染色。它是在固定前后未经其它化学试剂和高温聚合过程就完成了免疫反应，从而更好地保持了抗原性，有利于某些弱抗原的检出：其缺点是保存形态结构不理想，只适用于新鲜组织标本，由于抗体渗透性差，不易进行严格的对照研究。包埋后染色是先制成超薄切片再做免疫染色.敏感性高，重复性好，应用简便，节约抗体，形态结构保存好，并能在同一切片上作双重或多重标记；缺点是样品经前处理使抗原受到不同程度的破坏不利于弱抗原的检出。包埋后染色在使用非水溶性包埋剂(如 Epon812)时，常需在免疫染色前进行蚀刻，除去组织表面的树脂，以利于抗体和免疫金探针的渗透，常用蚀刻剂为过氧化氢。蚀刻剂的浓度时间需根据具体情况而定，蚀刻不足不利于抗体和探针渗透，蚀刻过度则会破坏组织结构。近年来，随着固定、包埋等方法的改进和方法敏感性的提高，包埋后染色法的应用范围亦不断扩大，目前已成为最常用的免疫染色方法。不包埋染色即先用冰冻超薄切片机制成超薄切片后进行免疫染色。这一方法避免了包埋前染色和包埋后染色的诸多影响因素，较有发展前途，但一些新的影响因素也有待克服，如冰晶形成影响了超微结构的观察。 除固定、包埋、聚合、蚀刻、免疫染色的方法外，胶体金免疫电镜技术尚存在一些影响因素，如胶体金和抗体的稀释度、冲洗程度、溶液pH值、切片厚度、金颗粒的大小、非特异染色、孵育时间等。抗体和胶体金的稀释度要适中，以保证在背景清晰的前提下获得较强的阳性信号，可采用方阵滴定法测定。溶液的 pH值要有利于保护抗原和抗体的活 性，冲洗要彻底，切片厚度以 60~80mm为宜。一般认为小颗粒的胶体金能更多地积聚于抗原所在部位，但直径小于3mm的金颗粒不易被发现，可用免疫金银增强法提高其敏感性。孵育应在温盒中进行，大于lh为宜。目前多主张孵育前加用0.5%~1%卵白蛋白、1%~2%牛血清白蛋白或正常羊血清，以消除非特异染色和背景染色。 4 胶体金免疫电镜技术的应用 4.1 在肿瘤研究中的应用 胶体金免疫电镜技术已成为目前最常用的免疫细胞化学方法之一，它具有灵敏度高特异性强、定位精确等优点，同时它还可以对抗原进行定性、定量、定位的分析与观察。应用免疫金双重或多重标记法，可将形态、功能和结构的研究融为一体，有助于了解同一组织或细胞内不同分子间的相互关系，以及它们的合成、分泌、转运等代谢过程。对于探讨肿瘤的发病机制、诊断、鉴别诊断以及指导临床治疗有重要的意义。肿瘤组织常用其相对特异性的标记物，如肝癌组织过量表达甲胎蛋白、胰岛素样生长因子I等，结肠癌异常表达癌胚抗原，神经内分泌肿瘤则异常分泌一些激素如 chromograninA等。使用免疫电镜技术检测这些抗原的表达，有助于相关肿瘤的分型、诊断和鉴别诊断。 Kawauchi等对分化的小圆细胞软组织肉瘤进行免疫电镜研究发现，横纹肌肉瘤同时表达肌组织特异性的肌动蛋白(actin)和结蛋白(desm in)，并且定位于肌丝或残留肌节中平行排列的短束中。尤因肉瘤和外周神经上皮瘤则可在细胞膜表面发现MI-2基因产物 p30/32。Mount等研究表明，位于后腹膜腔的肾母细胞瘤除可见桥粒和肾小球样结构以外，还可检测出中间丝蛋白成分波形蛋白(vimentin)和细胞角蛋白(cytokeratin)以及被膜抗原，这对肾外肾母细胞瘤的诊断具有十分重要的意义。Lombardi等发现所有的支气管肺类癌(5/5)和铬细胞瘤(2/2)的分泌颗粒上均可检测到 chro-mogranin A的表达，而在15例小细胞肺癌中，光镜下观察所有病例 chromogranin A均为阴性，而应用胶体金免疫电镜技术则检出其中3例 chromograninA有弱表达。甲状腺癌均过量表达 BCL-2蛋白，但在不同分化程度的癌组织中其分布形态有所不同。胶体金免疫电镜发现分化差的嗜酸性甲状腺癌中，BCL-2仅出现于线粒体周围的基质中。分 化较好的则除上述部位外，还可在线粒体嵴发现BCL-2蛋白。提示BCL-2与线粒体内某些成分相互作用，它可能以类似蛋白激酶样作用激活某种代谢途径，这与嗜酸性甲状腺癌的侵袭行为有关51 目前肿瘤病理主要根据显微镜下的形态改变而作出诊断。对良恶性病变和交界性病变往往缺乏客观尺度，数量概念模糊，这种诊断容易受主观因素影响，在一定程度上干扰了诊断的准确性。据文献报道，一些肿瘤的误误率达到20%~40%。应用胶体金免疫电镜技术结合生物体视学和图像分析技术，探讨良恶性肿瘤和癌前病变病理形态的定量诊断方法，可望使诊断的正确率明显提高。例如，根据子宫内膜腺上皮体密度和表面积密度等指标的改变，对子宫内膜增殖症与中、高度分化的子宫内膜癌进行鉴别，显著降低了误诊率。运用类似的方法，同样可以对其他肿瘤进行分型、分级和鉴别诊断。因此，不断提高胶体金免疫电镜对肿瘤的诊断与研究技术，有利于今后更加深入地认识肿瘤的发病机理及生物学特性，该技术必将在抗肿瘤药物的研究与开发、肿瘤的快速诊断体系的确立中发挥重要的作用。 4.2 在病毒检测中的应用 免疫金标记法可以明显地提高液体样品中待检病毒的检出率，灵敏度较高，可广泛应用于各种病毒，特别是小球形状病毒的电镜诊断。胶体金是用于免疫电镜的最佳标记物，因为它呈球形，非常致密，在电镜下具有强烈反差，容易追踪在电镜下检出抗原抗体复合物。用该法检出的病毒颗粒数比直接电镜法高100~300倍以上。 免疫胶体金电镜染色法最初用于细胞内某些生物活性物质的定位，它可以用两种大小不同的金颗粒来标记两种抗体，从而在同一标本上显示两种不同的抗原。现在，本法还用于病毒抗原及血清抗体的检测。用低温包埋常规超薄切片代替超薄冰冻切片成功地进行了单纯疱疹病毒的抗原定位。利用免疫胶体金染色法还可在电镜下检测血清中某种病原微生物的抗体。用被检血清处理电镜网格上的细菌或病毒抗原。当血清中含有相应的抗体时，抗原抗体相结合，再利用 SPA易于抗原抗体复合物结合的特性，加入用 SPA包被的胶体金，用金颗粒来指示结合于抗原上的相应抗体。在用阳性血清处理的细菌或病毒抗原上，金颗粒呈均匀地 附着；而用阴性血清者金颗粒则不均匀地分布，二者形成鲜明的对比。用蛋白A胶体金免疫电镜技术观察绵羊进行性肺炎病毒，在电镜下可见堆存的抗原-抗体复合物形成的抗体桥，在抗体桥上可以见到病毒粒子，还发现胶体金通过抗体桥分布在病毒粒子周围，胶体金的周围也有多量的病毒粒子和抗原内面细胞物质，并且包了一层抗体分子胶体金，能鉴别病毒和抗血清间的血清学相关性。本法对抗原和抗血清的纯度及效价要求不高，一般的实验室均能自制，能迅速而准确地测定出结果，可作为人和动物及植物病检测的常规方法 4.3 在生物传感器上的应用 近年来金标记被引入生物传感器中的应用研究增多。Kim等通过交流电导法检测了在叉指电极上的金标记的免疫凝集。从而实现了胶体金免疫层析试验的电化学检测方法。并且通过在胶体金上包被导电聚合物聚苯，提高电导法测定金标免疫反应的灵敏度。Brainina等1在标记胶体金标记A蛋白的基础上，制作了诊断森林脑炎的电化学免疫传感器，检测血清中的森林脑炎抗体及其浓度。 Tang等基于铂金电极修饰的胶体金提高了生物传感器检测 HABS表面抗体敏感性和稳定性。Kitano等10用基于胶体金表面等离子共振效应的电感受器测定胃蛋白酶的亲和常数。 5 存在的问题及展望 免疫胶体金技术是以金颗粒作为特异细胞成分的标记物，金颗粒本身的性质决定了该技术存在着一些问题：(1)胶体金颗粒大，渗透能力相对较差；(2)在操作过程中要求清洁程度高；(3)胶体溶液的稳定性较差。因此，胶体金溶液存放时间相对较短，保存时间6~12mo1~13]。这些问题导致免疫胶体金技术的应用受到一定限制。因此为扩大免疫胶体金技术的应用范围，在解决这些问题的基础上应做到两点：(1)进一步提高检测灵敏度。灵敏度的提高无疑会拓宽金免疫结合试验的检测范围。而采用信号放大系统如生物素抗生物素蛋白系统或免疫金银染色法进行银加强，并结合一些相应的简单检测仪器可能是最有希望的途径之一。(2)实现检测多元化，可采用在同一膜上作多种项目测定和多项目的组合测定两种方式。一次检测可同时得到一组结果，这对于检测某些具有联检意义的物质有很大的应用价值，如对献血者检查 HB- sAg艾滋病病毒抗体和抗原以及及 HCV。此外对在围产期检查抗弓形体、抗巨细胞病毒和抗风疹病毒等的抗体也极为有用[14，15]。 近年来，随着电镜技术的不断发展，极大地拓宽了其应用领域。免疫电镜技术为抗原亚细胞水平定位提供了有力工具。利用不同标记物在电镜下呈现不同的形态和电子密度的特点，可以建立了一些双标记或多标记免疫电镜技术，在同一系统中，同时观察不同抗原及受体在细胞表面和细胞结构中的定位【16，17]。免疫学、分子生物学等知识和摄影技术、计算机技术和自动化技术等的渗入，使电镜的使用更方便，精确性和放大倍数更高，它在动物学、医学和微生物学中的应用更广泛，由此电镜反过来又推动这些学科的进步。但是电镜成本昂贵、操作和组成结构复杂，又具有高压和电子辐射等不利因素。随着科学技术的发展和实践经验的增多，这些不利因素将逐步克服，如原子显微镜能在空气、液体和真空中操作，从纳米水平提供三维图像，使电镜更好、更方便和更广泛地为人类服务。 ( 参考文献 ) ( [1]Faulk W P， Taylor G M. 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