酱油中黄曲霉毒素检测方案

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00D &MACHINERY食品 与机械Vol.28，No.1Jan.2012第28卷第1期2012年1月 安全与检测2012年第1期 10.3969/j.issn. 1003-5788.2012.01.018 胶体金免疫层析法检测酱油中黄曲霉毒素B Study on aflatoxin Bi detecting in sauce bycolloidal gold immunochromatographic assay 赖卫华 刘道峰 邓省亮 LAI Wei-hua LIU Dao-feng DENG Sheng-liang (1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047；2.江西省科学院微生物研究所，江西南昌 330029)(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang， Jiangxi 330047，China；2. Institute of Microbiology， Jiangxi Academy of Sciences， Nanchang， Jiangxi 30029， China) 摘要：采用胶体金免疫层析法检测酱油中的黄曲霉毒素B。加标的酱油样品经提取后，以胶体金免疫层析法对其进行黄曲霉毒素B测定，并与酶联免疫吸附法进行比较。结果表明，当酱油中黄曲霉毒素含量超过国家限国标准(5 pg/kg)，胶体金免疫层析法检测结果为阳性，说明该方法能够满足酱油样品中黄曲霉毒素B监控的要求。 关键词：免疫层析法；酱油；黄曲霉毒素B Abstract： Colloidal gold immunochromatographic assay was used todetect the Aflatoxin Bi in Sauce. After spiking with aflatoxin Bi andextracting， the samples from sauce were detected by colloidal goldimmunochromatographic assay and enzyme-linked immunosorbentassay. The data showed that the result of colloidal gold immuno-chromatographic assay would be positive when the concentration ofaflatoxin Bi in sauce exceeding the maximum limit of China(5 ug/kg). The immunochromatographic assay can be used to screenaflatoxin B of sauce products. Keywords：immunochromatographic assay ； sauce ； aflatoxin Bi 黄曲霉毒素 B (aflatoxin B，AFB)主要由黄曲霉和寄生曲霉等真菌在代谢过程中产生，被国际肿瘤研究机构(IARC)列为 IA类致癌物质，其致癌性比二甲基亚硝胺强75倍。它还有致畸及致突变的作用，其毒性比氰化钾强10倍，比砒霜强68倍。由于含有大环共轭体系，稳定性非常好，它的分解温度为237~299℃，所以通过烹调一般不能破坏其毒性。AFB污染遍布世界各地，在热带和亚热带地区尤为严重。 酱油、腐乳、豆酱等是中国产销量比较大的传统发酵大 ( 基金项目：江西省主要学科学术和技术带头人培养计划项目(编号： 20113BCB22007 ) ) ( 作者简介：赖卫华(1968 一 )，男，南昌大学教授，博士生导师。 E-mail：talktolaiwh@ 1 63. com ) ( 收稿日期：2011-08-01 ) 豆制品，因其营养丰富易于消化吸收、风味独特等深受消费者的喜爱。但是大豆在收获前后、储藏、运输期间和加工过程中如果不能及时干燥，就有利于霉菌的生长，并有可能导致AFB 的污染。由于传统发酵调味品的生产仍处于比较粗放的境况，发酵过程主要采用传统自然发酵，制曲时杂菌数量多2。加之，生产所用的米曲霉、黑曲霉等与黄曲霉的生活条件相近，控制不严极易被黄曲霉等污染。因此，黄曲霉毒素已经是发酵调味品的一号安全隐患31. 徐坤等4J采用响应面法优化得出了混合发酵法控制郫县豆瓣中AFB含量的最佳制曲条件，该条件下AFBi 的含量是2.0621 ug/kg。陈嵘等5对家庭自制豆酱进行了检测，12个样品中5个含有 AFB。吴拥军等6对贵州地方腐乳污染 AFB 进行了检测，10个样品中都检出了 AFB ，其中两个样品的浓度超出了中国国家标准。孙婷婷等对酿造酱油中 AFB含量进行了调查，结果表明中国发酵酱油中AFB安全总体情况良好，但是 AFB 普遍存在于发酵酱油中，少数样品含量较高已接近欧盟标准2 pg/kg。 因此，对传统发酵产品中的AFB 进行有效监控是一项刻不容缓的工作。目前国内外黄曲霉毒素Bi的检测方法主要包括薄层色谱法、微柱法、高效液相色谱法、液相色谱一质谱法、荧光光度计法、酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法等L8-11]。薄层色谱法和微柱法灵敏度低，荧光强度的目测精确性差，操作人员要与大量的有潜在危害的有机溶剂和高浓度标准品接触，对操作人员身体健康有较大的安全隐患。高效液相色谱法操作复杂，所用仪器的价格和检测费用昂贵，不适于基层广泛使用。荧光光度计法是一种筛查方法，但需要繁琐昂贵的亲和层析方法对样本中的黄曲霉毒素进行提纯富集，难于大量推广。酶联免疫吸附测定法也需要熟练东操作人员，且过程较繁琐。胶体金免疫层析法是最为快速的 筛查方法，近年来已得到了初步的应用。黄曲霉毒素B胶体金免疫层析法利用的是竞争免疫层析的原理。试纸条从加样处开始分别为样品品、胶金垫、NC膜和吸水纸。胶金垫上喷有金标抗体，NC膜上喷有黄曲霉毒素B的BSA检测抗原(检测线)和驴抗鼠的二抗(控制线)。样本中的黄曲霉毒素B在流动过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和 NC 膜检测线上黄曲霉毒素B-BSA偶联物的结合。在控制线显色的前提下，根据检测线是否显色进行判断，如果样本中黄曲霉毒素Bi含量大于一定值，检测线不显颜色，结果为阳性。反之，检测线显红色，结果为阴性。该方法快速简便、价格便宜，容易被基层掌握并大面积推广，适合大批量样品的现场快速检测。本试验应用胶体金免疫层析法检测了传统发酵产品酱油中的 AFB，以确定是否可以检出黄曲霉毒素B超过国家限量标准的样品。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 黄曲霉毒素B：美国 Sigma 公司； 特级金标生抽酱油：佛山海天调味食品股份有限公司； 黄曲霉毒素B胶体金免疫层析试纸条：江西中德生物工程有限公司； 黄曲霉毒素B酶联免疫试剂盒：无锡中德伯尔生物技术有限公司； 三氯甲烷，甲醇，无水硫酸钠：AR级，上海国药集团化学试剂有限公司。 1.2 仪器与设备 电子精密天平：6102型，余姚纪铭称重校验设备有限公司； 数显恒温水浴锅：DK-S22，上海精宏实验设备有限公司； 恒温培养箱：ZDP-A2160，上海智诚分析仪器制造有限公司； 酶标测定仪：DNM-9602，北京普朗新技术有限公司。 1.3 方法 1.3.1 样品处理 准确称取5.00g酱油样品于25mL烧杯，加10 mL 蒸馏水稀释后转入125 mL分液漏斗中，加入25mL三氯甲烷，轻轻振摇3 min，置置分层。放出三氯甲烷，经三氯甲烷润湿的无水硫酸钠过滤，滤液于蒸发皿中65℃水浴通风挥发至干。待冷却后加入2 mL60%甲醇-水溶液(V/V)充分溶解，加入2mL蒸馏水使甲醇终浓度为30%，此为样品待检液。 1.3.2 标准品母液的准备 用甲醇溶解AFB标准品，再经30%甲醇享水溶液(V/V)稀稀至50 ng/mL，作为标准品母液。 1.3.3 样品加标 称取5.00g酱油样品，准确移入500 uL50 ng/mL的黄曲霉毒素B标准品母液，混匀。重复3次。提取方法按1.3.1进行。 1.3.4 酶联免疫法检测 每孔加入标准品溶液或提取完成的待检样品50 pL，然后每孔分别加入黄曲霉毒素B标记HRP溶液 50pL。轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置于37℃避光静置30 min。小心揭开封板膜，将孔内液体甩干，加入1×洗涤液250pL/孔，充分洗涤3次，用吸水纸拍干。底物溶液A和底物溶液B按1：1混合，轻轻振荡混匀，每孔加入混合后的底物溶液100 pL，37℃避光显色15 min。每孔加入终止液50 pL，轻轻振荡混匀，5 min 内测定 450 nm处吸光度值。 1.3.5 酶联免疫吸附法检测结果的分析 所获得的标准溶液或待测样品的吸光度值(B)除以0号标准品的吸光度值(B)再乘以 100%，即百分吸光度值。以黄曲霉毒素B标准品浓度为X轴，对应的百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线。应用 RIDAWIN 软件，计算出样品中黄曲霉毒素B的浓度。 1.3.6 胶体金免疫层析法检测及结果分析 试纸条平放，将100 pL样品加到试纸条的样本垫上，10 min 后，如果检测线上出现红色条带，说明样品呈阴性，如果检测线上没有出现红色条带，说明样品呈阳性。无论检测线是否出现红色条带，控制线都必须有红色条带，否则试验失效。 1.3.7 胶体金免疫层析法灵敏度检测 用30%甲醇一水溶液(V/V)稀释标准品母液，得到黄曲霉毒素B终浓度分别为1，2，3，4，5ng/mL的标准品。用试纸条检测的标准方法检测，根据试验结果判断试纸条的检测灵敏度。 1.3.8 胶体金免疫层析法检测酱油提取物 将添加了黄曲霉毒素B和未添加黄曲霉毒素B的酱油提取物用1.3.6方法检测，并和酶联免疫吸附法进行比较。 2 结果与分析 2.1 胶体金免疫层析法的检测灵敏度 由图1可见，在滴加30%甲醇一水溶液(V/V)为阴性对照时，胶体金免疫层析试纸条在检测线和控制线位置有明显清晰的条带，说明此溶剂体系不会对试纸条的显色情况造成可见影响。滴加浓度为1ng/mL 的AFB标准品，T线有较弱条带，未完全阻断。滴加2 ng/mL 及更高浓度的 AFB标准品时，T线位置未见明显条带，故所用试纸条在此检测体系中对AFB的最低检出浓度为 2 ng/mL。 1.0 ng/mL 2. 1 ng/mL 3.2 ng/mL 4.3 ng/mL 5.4 ng/mL 6.5 ng/mL 图1 胶体金免疫层析法检测AFB标准品的结果 Figure 1 Result of immunochromatographicassay for AFB standard samples 2.2 酶联免疫吸附法的标准曲线 将浓度0，0.05，0.15，0.3，0.9，2.7 ng/mL 的 AFB标准溶液加到酶标板的孔中，测定吸光度值，以黄曲霉毒素B标准品浓度为X轴，对应的百分吸光度值为Y轴，在半对数坐标纸上绘制标准曲线(见图2)。 图2 黄曲霉毒素B酶联免疫吸附法的标准曲线 Figure2 Calibration curve of AFB ELISA Kit 2.3 酱油中黄曲霉毒素B的提取结果 酶联免疫吸附法检测后通过RIDAWIN软件计算，未添加黄曲霉毒素Bi的酱油提取物，黄曲霉毒素B的检测结果都为阴性；平行3次添加黄曲霉毒素B 到酱油的过程中，浓度皆为 5 ug/kg，酱油提取物黄曲霉毒素B的检测结果分别为3.0，3.3，3.4 ng/mL。 2.4 胶体金免疫层析法的检测结果 由图3可知，试纸条滴加阴性样本提取液后均有清晰T线，而滴加标样本提取液的试纸条均未有T线显出，因此，AFB 含量高于 5 pg/kg 的酱油样本可以被此方法快速检出。 1~3.阴性样本提取液4~6.加标样本提取液 图3AFB 实际样本胶体金免疫层析法检测结果 Figure 31Result of immunochromatographic assayfor AFB in sample matrix 3 结论 免疫层析法只需一步加样，10 min 就能判定结果，可以筛查出黄曲霉毒素B超过中国国家限量标准的酱油。本方法具有灵敏度高、稳定性好、重复性高、简便易用、价格便宜 的优点，非常适用于大批量样品的现场快速检测，容易被基层掌握并大面积推广，适应中国经济技术发展状况。推广本法可以有效地防止黄曲霉毒素B中毒事件的发生，保护人民的身体健康。 ( 参考文献 ) ( 蒋立文，周传云，李宗军.传统发酵大豆制品的质量与安全控制探讨[ J ].中国酿造，2006(1)：1 ~3 . ) ( 2 王涛，车振明.浅谈发酵调味品中黄曲霉毒素素污染[J] . 中国调味品，2009，34(6)：34~35. ) ( 3 靳学敏，车振明.发酵调味品中黄曲霉毒素检测控制技术概论[J].中国调味品，2010，35(6)：30~31. ) ( 4 徐坤，王涛.响应面法优化混合发酵法控制郫县豆瓣中黄曲霉毒素Bi含量的最佳制曲条件研究[J]. 中 国酿造，2009(11)：28~ 30. ) ( 陈嵘，吕国忠，李军，等.家庭自制豆酱中黄曲霉毒素的检测[J ] .菌物学报，2008，27(6)：973~976. ) ( 6 吴拥军，龙菊，程昌泽，等.贵州地方腐乳污染毒素的检测J] . 山地农业生物学报，2009，28(3)：276~279. ) ( 7 孙婷婷，徐丹，晏丽，等.酿造酱油中黄曲霉毒素Bi含量调查与风险评估[J]. 食 品科技，2010， 3 5(12)：296~298. ) ( 8 余以刚，邱杨，吴晖，等.几种传统食品中黄曲霉毒素Bi的检测与安全评价[J].食品与机械，2007，23(4)：110~111. ) ( 9 陈新，饶正华，马东霞，等.免疫亲和柱荧光光度法和高效液相色谱法测定饲料中黄曲霉毒素[J].中国畜牧杂志，2007，43(24)： 50~54. ) ( 10 许菲菲，刘亚丽，田富饶，等.黄曲霉毒素检测方法研究[J].化学分析计量，2010，19(5)：93~94. ) ( 11 谢广有.黄曲霉毒素检测检法进展[J].职 业 与健康，2011，27 (6)：694~695. ) 信息窗 香精油可以抑制病原体 关于“冷冻条件下，柑橘香精油对牛肉中大肠杆菌O157：H7和沙门氏菌活力的影响”这项研究最初发表于《Journal Food Science》的网站上。 据美国科罗拉多州立大学和阿肯色大学的研究者称，在冷冻条件下，柑橘香精油可以抑制牛肉中食源性病原体的生长。研究者向牛腩中注射含有大肠杆菌O157：H7 和沙门氏菌的鸡尾酒，并以3.79 L/min 的速率在牛腩表面上喷洒提取于桔子的不同浓度(3%和6%)的柑橘香精油。实验结果显示，两种浓度条件下病原菌的生长都受到了有效抑制。 ( (来源：www.cifst.org.cn) ) China Academic Journal Electronic Publishing House. 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