中药中有效成分含量分析检测方案

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离子排斥色谱法测定生脉注射液中的有机酸 刘瑞1.2，孙焕3，李涛3，王钢力2*，林瑞超1.2 (1.北京中医药大学，中药学院，北京，100029；2.中国食品药品检定研究院，北京，100050；3.瑞士万通中国有限公司，中心实验室，北京，100005) 摘要 研究了抑制型电导检测器--离子排斥色谱法测定生脉注射液中柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等主要有机酸的分析方法。采用Transgenomic Ion 300有机酸柱，通过考察和优化硫酸浓度、丙酮比例以及柱温等条件，最终确定实验条件为5 mmol/L硫酸：丙酮(95：5)为淋洗液，柱温70℃，流速0.4 mL/min。其中柠檬酸、苹果酸和琥珀酸的线性范围分别为7.45-476.58 ug/mL、8.14-521.0 ug/mL和3.47-222.0 ug/mL，平均回收率分别为97.12%、96.94%和95.09%，RSD分别为2.7%、2.3%和1.9%。本研究测定了4个不同企业15批生脉注射液样品中3种有机酸的含量，结果表明不同生产厂家的生脉注射液中有机酸含量差异很大。该方法简单快速，灵敏度高，重复性好，可用于生脉注射液中有机酸的测定和质量评价。 关键词 离子排斥色谱，生脉注射液，有机酸 引言 生脉注射液是根据著名古方“生脉散”研制而成的由红参、麦冬和五味子三种药材经提取后制成的灭菌水溶液，现收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十五册(WS32-B-2865-98)，为国家中药保护品种。生脉注射液具有益气养阴，复脉固脱的功效，临床上用于气阴两亏，脉虚欲脱的心悸、气短，四肢厥冷、汗出、脉欲绝及心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等具有上述证候者。对生脉注射液进行物质基础研究时，化学成分预试验结果表明注射液中含有一定量的有机酸。目前文献对生脉注射液物质基础的研究多集中于人参皂苷和木脂素类成分[1.2]，但对有机酸类成分的研究尚未见报道。 根据生脉注射液的生产工艺和目前三种药材的的化学成分研究报道，分析生脉注射液中的有机酸主要来源于五味子药材。五味子中的酸性成分具有较强的生理活性。据文献报道，五味子药材中的酸性成分能使小鼠气管腺中中性粘多糖和酸性粘多糖减少③，具有祛痰和镇咳作用。五味子药材中含有柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等多种有机酸成分[4.5]，柠檬酸、苹果酸等有机酸对血管内皮细胞损伤具有一定的保护作用1，苹果酸具有抗疲劳，保护心脏，改善记忆能力等生理功能。为进一步阐明生脉注射液的物质基础，更好地控制其质量，保证 ( 通讯作者： 王钢力，E-mail： wanggl@nifdc.org.cn ) ( 临床用药安全有效，我们建立了生脉注射液中水溶性有机酸的含量测定方法。 ) 目前，有机酸的分析方法有滴定法、气相色谱法、高效液相色谱法[10]、毛细管电泳法1以及离子色谱法12]。酸碱滴定法只能测定总酸量，专专属性差，且难于选择合适的对照品；高效液相色谱法由于小分子有机酸极性强，保留弱，且多为紫外末端吸收，甲酸乙酸等流动相添加剂自身紫外吸收会干扰其测定，需采用磷酸缓冲盐体系，选择范围小，对于复杂样品难以达到理想的分离度；气相色谱法常因有机酸的沸点高，不易气化而需要对其衍生生后再进行测定，方法繁琐；而近年来发展的离子排斥色谱法(Ion-Exclusion Chromatography，IEC)样品前处理简单[13，14]，操作简便，准确度高，重现性好，可同时定量多种有机酸，因此被认为是分析各种有机酸极为有效的方法。本研究首次利用离子排斥色谱法对生脉注射液中几种主要水溶性有机酸进行了分析，结果稳定、可靠，可为中药注射液中有机酸类成分的分析提供参考。 2实验部分 2.1仪器与试剂 850离子色谱仪(瑞士Metrohm 公司，配备电导检测器、英蓝超滤系统、magIC Net 工作站)； Sartorius BT 224S 型电子天平。 生脉注射液由国内四个厂家提供。柠檬酸、苹果酸、琥珀酸(国药集团化学试剂有限公司)等有机酸均为分析纯；硫酸(北京化工厂)为分析纯，丙酮(J.T. Baker USA)为色谱纯；水为 Millipore高纯水；流动相经0.45 pm 滤膜过滤。 2.2对照品及供试品溶液的制备 取柠檬酸 119.2 mg， 苹果酸 130.3 mg， 琥珀酸 55.5 mg， 精密称定，置50mL 容量瓶中，加水稀释至刻度得对照品储备液，用水稀释配成一系列浓度的混合标样；精密量取生脉注射液2mL， 置50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液即得。 2.3色谱条件 Transgenomic Sep-ION-300色谱柱(300mm×7.8 mm，8um)；淋洗液：5mmol/L硫酸超纯水溶液：丙酮(95：5)；进样体积20pL，流速0.4 mL/min， 柱温70℃。抑制系统：100mmol/L LiCl。 结果与讨论 3.1Transgenomic Sep-ION-300色谱柱分离机理 Transgenomic Sep-ION-300色谱柱的填料是完全磺化的苯乙烯/二乙烯苯( PS/DVB )共聚物，因填料完全磺化，填料表现为带负电荷的球体，与带有负电荷的分析物之间有相斥作用，而不带电荷的分析物则可接近填料吸附。这种平衡可由有机酸的酸解离常数(pKa)来调节。 因此，分析物按离子排斥的机理得到分离并按pKa的顺序先后洗脱下来。生脉注射液中主要含有的三种有机酸柠檬酸、苹果酸和琥珀酸的Pka值分别为3.13，3.40和4.21，保留时间分别为13.9、16.6和19.7min， 实验结果与Transgenomic Sep-ION-300色谱柱的分离机理相互映证。 3.2色谱条件的优化 离子色谱中，淋洗液的种类和浓度对分离和检测灵敏度的影响较大，同时在分离不理想的情况下，可加入有机溶剂改善分离15]。实验中分别考察了 5 mmol/L HSO4， 10 mmol/LH2SO4， 5 mmol/L HSO4： Acetone(95： 5)， 10 mmol/L H2SO4： Acetone (95： 5)， 10 mmol/LHSO4： Acetone (90： 10)等多种淋洗液。结果表明在淋洗液中加入丙酮，可以有效地改善有机酸的峰形，提高灵敏度，同时提高目标化合物柠檬酸、苹果酸、琥珀酸与杂质的分离度，减少杂质干扰，有利于准确定量。而硫酸和丙酮的浓度对实验结果影响不大，因此通过几组实验对比，并考虑实验时间和成本等因素，最终选用 5 mmol/L H2SO4和 5%Acetone 为有机酸分析的淋洗液。实验中对柱温也进行了考察，结果表明选取高柱温70℃有利于改善峰形，提高分离度。在上述确定的色谱条件下，对照品及样品的典型色谱图见图1。 图1有机酸对照品(A)和生脉注射液色谱图(B) Fig 1 Chromatograms of standard solution of organic acids (A) and Sheng-mai Injection (B) 1. 柠檬酸(citric acid)；2.苹果酸 (malic acid)；3.琥珀酸(succinic acid) 3.3线性关系及检出限 精密量取对照品储备液，稀释成一系列不同浓度的混合标样，按2.3条件下进样，采集数据，，l以对照品浓度对峰面积进行线性回归，各有机酸的回归方程、线性范围、相关系数及检出限见表1。 表1有机酸的回归分析、线性范围、相关系数和检测限 Table 1 Regression analysis， linear range， correlation coefficient and detection limit 有机酸 回归方程 线性范围 相关系数 检测限(n=3) Organic acid Regression equation Linearrang(ug/mL) ( Correlation coefficient I Detection limit(ng) 柠檬酸citric acid Y=0.0419X-0.1501 7.45-476.5 0.9997 16 苹果酸malic acid Y=0.0462X+0.0042 8.14-521.0 0.9999 10 琥珀酸succinic acid Y=0.0469X+0.0067 3.47-222.0 0.9997 16 3.4精密度、重复性和稳定性 取混合对照品溶液重复进样6次，各有机酸峰面积RSD分别为柠檬酸2.3%，苹果酸1.4%，琥珀酸0.37%。取同一批注射液样品，平行制备6份供试品溶液，依法测定含量，柠檬酸RSD为1.4%，苹果酸RSD为1.1%，琥珀酸RSD为1.3%。 取同一份供试品溶液，分别于0、2、8、16、24小时进样测定，依法测定含量，结果表明柠檬酸、苹果酸和琥珀酸在24h内稳定， RSD分别为1.3%、1.2%和2.3%。 3.5回收率试验 取有机酸对照品(柠檬酸122.8 mg， 苹果酸45.2 mg， 琥珀酸34.8 mg)，精密称定，置50mL容量瓶中，加水稀释至刻度得对照品储备液；精密量取已知含量的生脉注射液(样品A1)2mL9份，置50mL量瓶中，分为3组，分别加入对照品储备液2.5 ml， 3.0ml和3.5ml(加入量近似为2ml样品中柠檬酸、苹果酸和琥珀酸含量的80%，100%，，120%)，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液依法测定。根据测得量和加入量计算回收率。柠檬酸平均回收率为97.12%， RSD为2.7%；苹果酸平均回收率为96.94%， RSD为2.3%；琥珀酸平均回收率为95.09%， RSD为1.9%。 3.6样品测定 分别对四个厂家15批样品依法进行测定，测定结果见表2。从表中可以看出不同厂家三种有机酸的含量差异很大，柠檬酸的含量在0.0071~4.6727 mg/mL之间；苹果酸的含量在0.0608~2.1169 mg/mL之间；琥珀酸的含量在0.0202~0.8641 mg/mL之间； 三种有机酸含量之和在0.0917~7.3535 mg/mL之间。生脉注射液中的有机酸主要来源于五味子，五味子的生产工艺为水提醇沉后活性炭煮沸过滤。不同厂家的注射液中有机酸含量差异大可能与各生产厂家的原料来源、处理方式以及生产工艺的具体参数不同有关。 表2 注射液样品中柠檬酸、苹果酸和琥珀酸的含量测定结果(n=3) Table 2 Contents of citric acid， malic acid and succinic acid in 15 batches of Sheng-mai Injections(n=3) 样品 柠檬酸 苹果酸 琥珀酸 总和 Samples Citric acid (mg) Malic acid (mg) Succinic acid (mg) Sum (mg) A1 3.0696 1.1207 0.8641 5.0544 A2 4.6727 2.1169 0.5639 7.3535 B1 0.0079 0.0643 0.0267 0.0989 B2 0.0085 0.0631 0.0202 0.0917 B3 0.0083 0.0860 0.0205 0.1148 B4 0.0071 0.0608 0.0263 0.0943 C1 0.0552 0.6000 0.4067 1.0619 C2 0.0776 0.5960 0.2370 0.9105 C3 0.0626 0.4221 0.2308 0.7156 C4 0.0904 1.3823 0.2920 1.7647 C5 0.0521 0.6192 0.1890 0.8083 C6 0.0502 0.5334 0.1601 0.6935 D1 1.0898 1.0233 0.0974 2.2105 D2 1.0459 0.9694 0.0917 2.1070 D3 1.1250 1.0456 0.1006 2.2712 References ( Zheng C haonan， H ao Haiping， Wang X u an， W a ng Guangji， Sang Guowei， Li a ng Ya n ， Xi e Lin， Xia Chunhua， Yao Xilin. 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Chinese Journal of Analytical Chemistry(分析化学研究简报)，2002，30(3)：304-306 10 Jin Gaowa(金高娃)， Zhang Feifang(章飞芳)， Xue Xinya(薛兴亚)， Xu Qing(徐青)， LiangXinmiao(梁鑫淼). Chinese Journal of Analytical Chemistry(分析化学研究简报)，2006，34(7)：987-990 11 Yang Yuanjuan(杨元娟)， Xia Zhining(夏之宁)， Yang Yuanmei(杨元梅). Laser Journal(激光杂志)，2009， 30(6)：94-95 12 Lin Huayin(林华影)， Lin Fenghua(林风华)， Sheng Lina(盛丽娜)， Li Yidan(李一丹)， ZhangQiong(张琼). Chinese Journal of Chromatography(色谱)，2007，25(1)： 107-111 ( 13 Tian Peng(田鹏)， Xu Ye(徐烨)， Li Y ing(李莹)， S o ng Ximing(宋溪明)， Liang Zhide(梁志德). Journal of Analytical Science(分析科学学报)， 2 001，17 ( 6)：483-485 ) ( 14 Yuan Xiaoyu(原小寓)， W u We i (吴伟)， Yu Hong(于泓). Life Science Instruments(生命科 学仪器)，20 0 5， 3(3)： 29-33 ) ( 15 Yuan Xiaoyu(原小寓)， W u Wei(吴伟)， Yu Hong(于泓). Fen Xi C e Shi Xuebao(Journal o f Instrumental Analysis)，2008，27(1)：76-78. ) Determination of Organic Acids in Sheng-mai Injection by Ion Exclusion ChromatographyLiu Rui12， Nie Lixing ’， Sun Huan’， Li Tao’， Wang Gangli2*， Lin Ruichao 12 (1. Beijing University of Chinese Medicine， School of Chinese Pharmacy， Beijing， 100029； 2. National Institutefor Food and Drug Control， Beijing， 100050；3. Metrohm China Limited， Central Laboratory， Beijing， 100005) Abstracts A method was developed for the separation and determination of three organic acid， vizcitric acid， malic acid and succinic acid in Sheng-mai Injection by ion exclusion chromatographywith suppressed conductivity detection. The chromatographic separation was performed on aTransgenomic Sep-ION-300 column (300 mmx7.8 mm， 8 pum) at 70℃ and eluted with a mixtureof 5 mmol/L sulphuric acid and acetone (95：5) at the flow rate of 0.4 mL/min. The effects of the concentration of sulphuric acid， the volume ratio of acetone and column temperature wereinvestigated and optimized. The calibration curve for citric acid， malic acid and succinic acid wasin a good linearity in the range of 7.45-476.5 ug/mL，14-521.0 ug/mL and 3.47-222.0 ug/mL，respectively. The average recovery for citric acid， malic acid and succinic acid was 97.12% withRSD 2.7%， 96.94% with RSD 2.3%， and 95.09% with RSD 1.9%， respectively. The validatedmethod was successfully applied to determination of organic acids in 15 batches of Sheng-maiInjection and the results suggested that there was a great variation among different samples. Inconclusion， these results demonstrated that the method proposed was simple， sensitive andreproducible for the analysis and quality evaluation of organic acids in Sheng-mai Injection.Keywords Ion Exclusion Chromatography， Organic Acids， Sheng-mai Injection