动物饲料中霉菌毒素检测方案(液质联用仪)

智能文字提取功能测试中

[应用纪要] 使用Xevo TQ-S为定量测定动物饲料和青贮饲料中的霉菌毒素开发一种灵敏的多残留LC-MS/MS方法 Sara Stead， Dominic Roberts， Antonietta Gledhill， Theo de Rijk， Christof Van Poucke，和 Sarah De Saeger沃特世公司(英国曼彻斯特)；2RIKILT食品安全研究院(荷兰瓦格宁根) 根特大学(比利时根特) 应用优势 提供了一种LC-MS/MS定量检测方法，可同时测定动物饲料和青贮饲料中的33种霉菌毒素。 适合作为灵敏的筛查检测方法，用于测定动物饲料中低水平的霉菌毒素污染。 ■通过结合简单的分析前萃取稀释步骤，)减少了复杂基质效应。 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC@I-Class 系统 ( Xevo TQ-S ) TargetLynxIM应用软件 QuanpedialM数据库 关键词 霉菌毒素，饲料，青贮饲料，单端 孢霉，白僵菌素，恩镰孢菌素，烟 曲霉毒素，赭曲霉毒素， T2， HT-2， 交链孢霉，串联四极杆 简介 目前已确认可能存在于动物饲料中的霉菌毒素超过400种，据报道，世界范围内有25%的谷物可能受到霉菌毒素污染1。 动物饲料的分析包括青贮饲料，这些基质的复杂性和非均质性成为了主要的技术难题。尽管欧盟规定的霉菌毒素浓度允许限值相对较高(ug/kg)23，但在某些物种(家禽和猪)中经常观察到pg/kg水平浓度下产生免疫毒性和饲料摄取问题等毒性作用4。因此，通常要求饲料达到较低的检测限。此外，采收前后的虫害侵袭同时会造成污染，导致出现单端孢霉、白僵菌素、恩镰孢菌素、烟曲霉毒素、赭曲霉毒素、T2、HT-2和交链孢霉等毒素，例如在单一饲料样品中5. 本应用纪要介绍了一种可对多种动物饲料和青贮饲料提取物中的33种相关霉菌毒素进行定量测定的方法开发。该方法采用与Xevo TQ-S联用的Waters@ ACQUITY UPLC I-Class系统对饲料提取物中的多种霉菌毒素进行快速、高质量、超灵敏的分析。我们的目标是研究基质稀释效应、提高仪器灵敏度，从而克服离子抑制等常见分析难题，降低基质差异效应。 时间 A B 曲线 0 90 10 ES+/-转换 3 90 10 3.4kV 10 30 70 150℃ 10.1 10 90 6 12 0 90 150L/h 2.1 90 10 ： 800 L/h 15 90 10 表2.使用Quanpedia优化饲料和青贮饲料中多种霉菌毒素Xevo TQ-S分析的MS/MS条件。 q271.2>256.2 图1显示出通过MRM通道和自动时间窗口计划功能在由Quanpedia生成的每个色谱峰上获得至少12个点。此方法可在Quanpedia数据库中找到。 图1. Quanpedia数据库生成的33种霉菌毒素的MRM通道(ESI+/-模式)和自动时间窗口计划功能。 结果与讨论 对饲料和青贮饲料样品的纯净稀释提取物进行分析，r，然后对照溶剂标准品或基质匹配标准品进行定量(如适用)。正如预期，基质干扰特征非常复杂，并且不同样品之间的基质干扰存在差异，可通过 RADAR功能得到测定结果。图2显示了一种猪饲料纯提取物的LC-MS/MS谱图。我们发现，在全扫描模式下得到的基峰强度(BPI)谱图和同时采集到的样品中五种霉菌毒素的MRM通道(如插图所示)在高基质背景区域发生洗脱。高浓度的基质背景可导致目标分析物产生不同的离子抑制效应，从而影响整体分析性能。因此，对复杂基质中的霉菌毒素进行定量分析时，通常会采用基质匹配校准物、标准品加入法和同位素标记内标以克服基质效应，提高定量准确性和精度。 图2.天然污染猪饲料提取物的基峰强度(BPI)色谱图，显示了全扫描模式(MS功能2， RADAR)下监测到的背景基质特征以恩镩狗菌及烟曲霉毒素B1和B2与恩镰孢菌素A、A1、B、B2的MRM通道(MS功能1)。 在本研究中，我们使用简单稀释步骤结合超高灵敏度Xevo TQ-S以降低基质效应，从而提高不同样品类型之间的测量重复性和准确性。表3显示了用六种霉菌毒素加标的六种不同饲料提取物的重复性数据，进样前经1：10稀释。结果发现，所有加标霉菌毒素的日内方法精度(用RSD%表示)良好，均低于23%。 对更多饲料(12个)和青贮饲料(10个)样品提取物使用相同的稀释系数(1：10)，按照优化的XevoTQ-S条件检测33种霉菌毒素，并对照相应校准系列进行定量。图3为生成的TargetLynx报告，报告显示了方法的线性和灵敏度以及未知样品的浓度计算结果。 表3.六种霉菌毒素加标至不同动物饲料(n=6)的重复性数据，提取物在Xevo TQ-S分析之前经过1：10稀释。 饲料类型 1：10稀释动物饲料提取物的浓度测定结果(ng/g)* 恩镰孢菌素A 恩镰孢菌素A1 恩镰孢菌素B 恩镰孢菌素B1 烟曲霉毒素B1 烟曲霉毒素B2 玉米麸质 305.9 165.6 48.0 86.1 14.0 17.1 猪饲料 275.5 160.5 43.6 56.5 17.0 17.5 黑麦 258.5 136.1 61.8 62.1 18.7 19.3 燕麦 221.9 115.5 41.4 62.0 22.7 20.1 葵花籽 197.4 117.7 48.2 77.1 13.0 13.2 牛饲料 193.9 102.2 32.0 51.3 14.0 14.8 平均值 242.2 133.0 45.8 65.9 16.6 17.0 SD 45.1 25.7 9.8 13.1 3.7 2.6 %RSD 19 19 21 20 22 15 *霉菌毒素在提取前加标至饲料样品 图3.TargetLynx报告显示了Xevo TQ-S测定含量低至0.25 ug/kg的烟曲霉毒素B2标准品的线性和灵敏度。 [应用纪要] 表4和5显示了从自然污染的饲料和青贮饲料样品中检测出的霉菌毒素浓度测量结果以及各自的LOD计算结果(S：N21：3)。结果发现，所有检测出的霉菌毒素的LOD值在溶剂和基质中均处于ppt至低ppb的范围内。自然污染的饲料样品中含有多种霉菌毒素(33种监测的可能霉菌毒素中的3到12种)，浓度相当于1以下到300 ug/kg左右。我们认为此方法适合作为一种高灵敏度的筛查有/无的方法。由于污染物浓度由溶剂标准校准系列确定，因此基质效应可能仍然对定量性能有所影响。 表4.使用两个MRM通道检测12个不同动物饲料样品中一系列霉菌毒素的浓度测量结果，样品在Xevo TQ-S分析之前经1：10稀释。 霉菌毒素 LOD 动物饲料样品检测结果和类型 (ng/g) U1/ 牛 饲料 U2/ 猪饲料 U3/ 玉米 麸质 U4/DivaL 关键 猪饲料 U5/Alpha 肥育 猪饲料 U6/ 黑麦 U7/ 大麦 U8/ 小麦 U9/ 燕麦 U10/ 玉米 U11/ 葵花籽 油 U12/ 猪饲料 15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇0.50 nd nd 152.8 nd nd nd 13.2 33.4 nd nd nd nd 黄曲霉毒素B1 0.05 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.2 nd 黄曲霉毒素B2 0.05 nd nd 0.8 nd nd nd nd nd nd nd 0.1 nd 黄曲霉毒素G1 0.05 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.1 nd 黄曲霉毒素G2 0.05 0.3 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 交链孢酚 0.06 nd 3.2 nd nd nd 5.3 nd nd 7.6 2.6 10.0 nd DON 0.13 nd 21.2 283.6 13.2 18.4 nd nd nd 4.8 nd 0.3 nd 恩镰孢菌素A 0.10 59.3 6.3 1.4 15.7 39.9 9.7 11.7 0.4 3.2 nd nd 50.5 恩镰孢菌素A1 0.10 148.6 17.1 3.2 40.1 19.0 14.2 34.1 0.5 4.9 nd nd 122.4 恩镰孢菌素B 0.10 125.2 43.3 5.8 65.3 53.3 92.8 52.9 0.4 9.0 nd nd 116.1 恩镰孢菌素B1 0.10 263.0 41.8 5.5 72.1 32.3 42.8 64.0 0.5 9.9 nd nd 238.2 烟曲霉毒素B1 0.10 0.3 0.7 18.9 nd 4.0 nd nd nd 0.4 92.8 nd 1.7 烟曲霉毒素B2 0.10 0.1 nd 3.1 nd 0.8 nd 0.2 nd nd 16.0 nd 0.3 HT-2毒素 0.25 nd nd nd nd nd nd nd nd 3.9 nd nd nd 赭曲霉毒素A 0.06 0.1 nd nd 0.1 nd 0.2 2.8 nd nd nd nd 0.1 酪青霉毒素 0.10 nd 0.3 0.3 0.2 0.1 nd nd nd nd nd nd nd *浓度按照溶剂校准系列确定。 与复合饲料样品相比，青贮饲料样品中检出的霉菌毒素较少(33种潜在霉菌毒素中的0到3种)。图4显示了1：10稀释后的加标青贮饲料提取物色谱分离图。浓度计算结果在约20至260 ug/kg的范围内。由加标对照样品测定的17种霉菌毒素的回收率在89%至108%之间，平均值为96%。 图4.使用ACQUITY UPLC I-Class系统和Xevo TQ-S得到的加标青贮饲料提取物色谱分离结果。 表5.使用两种MRM通道鉴别10个不同青贮饲料样品中一系列霉菌毒素的浓度测量结果和回收率%，样品在Xevo TQ-S分析之前经1：10稀释。 霉菌毒素 1：10稀释青贮饲料样品的浓度测量结果(ng/g)* 青贮饲料样品鉴定结果 LOD (ng/g) 加标对照S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10回收率% 黄曲霉毒素B1 0.1 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 95 黄曲霉毒素B2 0.2 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 104 黄曲霉毒素G1 0.6 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 93 黄曲霉毒素G2 0.4 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 94 DON 0.9 958.1 1310.0 158.4 550.8 435.4 359.8 216.4 nd 261.7 nd 100 恩镰孢菌素A 0.1 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 94 恩镰孢菌素A1 0.1 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 94 恩镰孢菌素B 0.1 nd nd 64.0 72.4 50.9 108.4 204.1 nd 82.7 nd 89 恩镰孢菌素B1 0.1 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 94 烟曲霉毒素B1 2.0 nd nd nd 256.3 nd nd nd nd nd nd 93 烟曲霉毒素B2 0.4 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 95 HT-2毒素 0.8 nd nd nd nd nd nd 36.2 nd nd nd 97 赭曲霉毒素A 0.8 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 103 T2毒素 5.0 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 96 玉米赤霉烯酮 2.5 170.2 140.2 108.4 42.5 nd 84.2 76.1 nd 76.3 nd 108 白僵菌素 0.2 nd 72.5 23.2 nd nd 28.4 22.5 nd nd nd 96 腾毒素 0.1 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 92 检出霉菌毒素数量 2 3 4 4 2 4 5 0 3 0 17 ( 结论 ) 使用Waters ACQUITY UPLC I-Class系统结合配有Quanpedia数据库的Xevo TQ-S， 开发了一种适用于同时测定动物饲料和青贮饲料中33种霉菌毒素的LC-MS/MS定量检测方法。 由于TQ-S仪器具备超高灵敏度，在分析前增加一个简单的提取物稀释步骤，可以降低这些难以分析的样品的复杂基质效应，获得良好的方法重复性和准确性。 结果显示日内重复性(RSD%)s22%，0，青贮饲料中17种霉菌毒素的平均回收率为96%。 这种优化方法已用于鉴定多种样品中的一系列霉菌毒素并测定其浓度。 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. ( 致谢 ) 感谢RIKILT食全安全研究所(荷瓦瓦格宁根)和根特大学(比利时根特)提供动物饲料和青贮饲料提取物及分析标准品。 ( 参考文献 ) ( 1. World-grain news website accessed on 29th October 2012：ht t p：// ww w.world- grain.com/ N ews/News%20Home/Features/2011/6/Mycotoxins.aspx?cck=1 ) ( 2. EC C ommission Directive 2003/100/EC(2003) Official Journal of theEuropean Union L285 3 3-37. ) ( 3. ECCommission Recommendation 2 0 06/576/EC (2006) Of f icial Journalof the European Union L229 7-9. ) ( 6.1 GJMo l ，PPlaza-Bolanos， P Zomer， TC de Rijk， A A M Stolker， andP Mulder. Anal Chem. 80： (24)9450-9459，2008. ) ( 成都：0 2 8-65784990 ) ( 免费售后服务热线：800(400)8202676 WWw.waters.com ) 灵敏的多残留LC-MS/MS定量检测方法开发