植物源性食品中24种农药残检测方案(气质联用仪)

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GPC-GCMS在植物源性食品中24种农药残留测定的研究 卢大胜，张梅，汪国权 (上海市疾病预防控制中心，200336) 摘要：本研究采用 GPC-GCMS对蔬菜水果、谷物、大豆和茶叶样品中的24种有机氯、菊酯和杀螨剂残留测定研究，以及现有前处理方法，如QuEChERS 方法进行了联用，表明GPC-GCMS能很好地去除植物源性食品中的干扰物质，降低分析背景、改善峰形，从而能更好地定性与定量；结合进一步的净化方法，如PSA或C18等，能适用于一些特殊农产品或特定目标化合物的检测需求。GPC-GCMS和QuEChERS方法在蔬菜水果中的联用分析具有很好的回收率和低的变异系数，实现快速、简单、便宜、有效、可靠和安全的目的。 关键词：农药残留、GPC-GCMS、QuEChERS、食品安全 近年来农药多残留分析已成为监测是食品安全分析和监测的重要组成部分"，同时也是分析领域的一个研究热点之一。农药多残留分析过程包括有提取、净化、测定等2，其中净化方法包括石墨碳黑、弗罗里硅土、碳十八、伯仲胺基和阴阳离子交换树脂为填料的固相萃取方法，和凝胶渗透色谱 (GPC)方法等③。 GPC 方法能很好地去除样品基质中可能干扰目标化合物分析的油脂、色素(叶绿素、叶黄素等)、生物碱、聚合物等大分子化合物，所以GPC在农药残留的分析中得到广泛的应用[4-6]。此外在各国法规中也越来越多地使用到GPC净化技术，如在欧盟标委会技术委员会的农药残留测定标准(TC 275)中，脂肪类农药残留标准(EN 1528：1996)的8种净化方法中有3种为 GPC方法，非脂肪类农药残留标准 (EN 12393：1998)的5种净化方法中有2种为GPC方法；日本厚生劳动省在蔬菜、水果、谷物和豆类农药残留的分析方法也采用了 GPC净化方法。常规的GPC 方法一般采用离线方法，由于存在速度慢、有机溶剂使用量大、操作烦琐等问题，限制了 GPC技术在这一领域的广泛使用。 本文以植物源性食品(蔬菜水果、谷物豆类和茶叶)为对象，对24种有机氯、菊酯和杀螨剂残留进行QuEChERS 提取和在线GPC-GCMS的测定研究，以实现自动化、快速、适用于批批量的农药残留分析。 1、试剂、仪器及其器材 1.1 试剂 正己烷、丙酮和乙醚均为农残级，购自 Sigma Aldrich；；α-六六六、β-六六六、、Y-六六六、8-六六六、p，p'-滴滴涕、、p，p'-滴滴滴、p，p’-滴滴伊、o，p’-滴滴涕(含量>99.9%)、六氯苯(含量>99.0%)、七氯(含量>99.0%)、艾氏剂(含量>98.0%)、狄氏剂(含量>98.5%)、异狄氏剂(含量>98.5%)、硫丹(含量>98.0%)、噻嗪酮(含量>99.0%)、三氯杀螨醇(含量>95.0%)、三氯杀螨砜(含量>99.0%)、联苯菊酯(含量>98.0%)、甲氰菊酯(含量>99.5%)、功夫菊酯(含量>98.0%)、氯菊酯(含量>98.0%)、氯氰菊酯(含量>98.0%)、氰戊菊酯(含量>98.0%)和溴氰菊酯(含量>99.5%) 购自 Chem Service。 氦气(99.999%)，购自昆山普莱克斯实用气体有限公司；氯化钠、无水硫酸镁和无水硫酸钠的含量>98.0%，购自国药集团化学试剂有限公司，使用前在400℃烘2小时。 1.2仪器及其器材 GPC-GCMS 系统， GPC 系统包括LC-10ADvp泵、SIL-10ADvp 自动进样器、Shodex CLNpak EV-200AC凝胶渗透色谱柱(2mmx150mm)、CTO-10ASvp柱温箱、SPD-10Avp紫外检测器、流动通道选择阀、SCL-10Avp系统控制器和C-R8A plus数据处理机； GCMS 系统包括岛津QP2010，配有 PTV-2010大体积进样器，毛细管色谱柱为： Rtx-5ms (0.25mm(ID)x30m(L)，Thicknes 0.25om)。 碳黑、弗罗里硅土SPE小柱(SUPELCO， 3mL，500mg)， C2 Platform shaker 电动振荡器(EDISON)；IKA T18 Basic 组织捣碎机； RJ-TDL-5A离心机(瑞江牌)；13mm有机过滤膜(Millipore Corporation)； 2、实验方法 2.1 实验方法与结果 2.1.1实验室前处理方法 A.样品制备： 取茶叶或粮食样品经粉碎机粉碎，过420 um的筛制成茶叶或粮食试样；取蔬菜或水果样品擦净，蔬菜要去掉非可食部分，然后用食品处理器粉碎，制成蔬菜或水果试样。 B.样品的提取： 取10g茶叶或粮食试样(20g蔬菜或水果试样)于50mL的离心管中，分别加入10mL水和10mL正己烷：丙酮(1：1)放置30min后，用组织捣粹机匀浆 5min， 提取液移入离心管中。再用10mL正己烷：丙酮(1：1)清洗组织捣粹机，合并提取液。在电动震荡器上震荡5min， 然后在转速为4000转/min 条件下离心10min， 移取上清液。再向离心管中加入10mL正己烷，重复提取、离心3次，收集合并上清液，加入无水硫酸钠干燥后，定容到25mL。 C.样品的层析： 取上述的上清液 10mL 于浓缩管中，在37℃用氮吹仪浓缩到1mL。 将含有50mg分散性石墨碳黑的弗罗里硅土小柱的柱顶端加入约1cm高的无水硫酸钠，分别各用4ml洗脱剂丙酮/乙醚/正己烷(2：2：1)和正己烷冲洗，将样品溶液移入萃取柱，用0.5mL的正己烷清洗浓缩管3次并并移到萃取柱中，用4mL乙醚/丙酮/正己烷(4：4：2)洗脱液洗脱，收集洗脱液于浓缩管中，在37℃用氮吹仪浓缩到1mL，过膜后置于冰箱保存待分析。 2.1.2 QuEChERS 前处理方法 按照文献方法[10]，蔬菜水果样品(黄瓜)的制备与上述实验室方法相同，取10g制备的样品于40ml具塞聚四氟乙烯的离心管中，加入10ml含1%的醋酸的乙腈溶液和1g醋酸钠，摇匀后加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，乘热剧烈震荡 1min， 在4000rcf条件下离心1min， 取1ml的上清夜于含有 50mgPSA、50mgC18和20mgCarb的离心管中，剧烈震荡1min， 再在4000rcf条件下离心2min， 取上清液过膜后置于冰箱待上机。 2.2标准溶液系列 将各标准农药溶于丙酮，配成5mg/mL的标准储备液，置于冰箱保存备用。用标准储备液稀释配制0.01——0.15cg/mL的标准工作溶液。 2.3 GPC-GCMS分析条件 泵流速：0.1ml/min；柱温：40℃；农药残留馏分截取时间段：4——6min；栽气吹扫：0.1min；流动相：丙酮/环己烷(3：7)；PTV 进样口程序升温：120℃ (4.5min) 80C/min 250℃ (34min)；进样模式：不分流进样；进样时间：7min；柱温箱程序升温：82℃(5min) 8C/min 280℃ (10.25min)；柱流速控制：恒压，120Mpa；载气总流速： 30ml/min；柱流速：1.75 ml/min MS离子源温度：200℃；接口温度：250℃；溶剂延迟时间：8min；检测电压：1.05KV；质谱检测模式：SIM，进样量：实验室方法为 10cd， QuEChERS 方法为20 图1.24种农药(0.05og/ml)的标准质量色谱图 3、讨论 3.1 GPC-GCMS在常规前处理方法中的的应用 在黄瓜农残测定实验中，按照实验室前处理处品后分成两份，一份先通过 GPC 再进入GCMS， 另一份直接进入GCMS。通过比较其谱图，可知直接进样进行GCMS分析的背静明显高于经过 GPC凝胶色谱柱的分析，同时当开启灯丝保护功能时，直接进样分析的由于基质多质谱中离子过饱和而使仪器灯丝连续熄灭(见图2)。 图2.黄瓜的GPC-GCMS (A) 和GCMS (B) 农残图谱比较 此外干扰物的干扰直接影响到农药的定性和定量，如当黄瓜中添加六氯苯标准品后(Hexachlorobenzene)的直接进样GCMS分析的谱图，无论是在峰形还是在强度上都要差于经过GPC后 进行 GCMS的谱图(见图3)。当当样品基质比较复杂时，如大豆农残分析过程中，直接进GCMS样品由于干扰物而使除少数几个农药(p，p'-DDE、狄氏剂、噻嗪酮、异狄氏剂、p，p'-DDD 和联苯菊酯)外其他的基本无法进行定性和定量(见图4)。 图3.黄瓜中六氯苯的 GPC-GCMS (A) 和GCMS(B)的图谱比较 图4.大豆样品中几个农药(A、B为六氯苯，C、D为三氯杀螨醇)的GPC-GCMS (A、C) 和GCMS (B、D)图谱比较 3.2 QuEChERS 方法与在线 GPC-GCMS联合使用 QuEChERS 方法直接进 GCMS， 也出现了背景明显高于经GPC-GCMS、灯丝熄灭等现象，从而影响了一些农药的定性和定量，如七氯、o，p'-DDT 和氰戊菊酯等(见图5)。在回收率实验中，25个农药加标量为 0.01ug/kg条件下，有18个回收率在80-120%；有5个绝对回收率超过120%，可能来源于基质的诱导增强效应导致，可通过空白基质标准或衬管的惰性化等措施进行减少和消除；三氯杀螨醇的回收率为60%，这可能由于三氯杀螨醇在基质中的不稳定性造成的[11]，另外这25个农药的相对标准偏差在20%之内。所以QuEChERS方法结合GPC-GCMS测定蔬菜水果中的农残应该是现有方法中值得关注的一种方法，它把QuEChERS方法和GPC-GCMS的优势结合在一起，能够便利、快速、高效地测定蔬菜水果中的农残。 图 5. QuEChERS 方法提取的两种农药的 GPC-GCMS(A、C)和 GCMS (B、D)图谱比较 (A、B为o，p'-DDT，C、D为氰戊菊酯) 3.3 GPC-GCMS 在复杂植物源性农产品的农残测定中的应用 GPC 在茶叶农残测定中主要是除去色素(叶绿素、叶黄素)、生物碱、聚合物等大分子化合物，从而降低实验背景，减少待测物干扰。但对茶叶中的一些干扰性小分子物质去除能力较弱，所以茶叶样品在通过实验室方法净化后进 GPC-GCMS 很多农药如六六六、七氯、硫丹、p，p'-DDD、三氯杀螨砜和氰戊菊酯等都不能很好地定性和定量。针对这一情况，参考GB/T 19648-2005的方法，在实验室方法净化的基础上再进行了深度净化，即实验室方法净化后分别过C18和PSA填料的SPE小柱，实验结果表明C18和PSA 都能进一步去除背景， C18略好于 PSA(见图10)。 图6.茶叶样品在不同前处理方法下的 GPC-GCMS 图谱比较 (A：实验室方法，B为实验室方法+PSA，C为实验室方法+C18) 3.4 QuEChERS 方法与在线GPC-GCMS联合使用的加标回收测定 在本实验过程中采用在空白样品基质(黄瓜)中，添加农药标准的方法进行测定，绝对添加量为0.10g， 经过提取、净化、测定，结果如下： 表1.黄瓜用QuEChERS 提取、GPC-GCMS 测定的回收率和相对标准偏差(n=5) 农药 回收率(%) 相对标准偏差(%) 农药 回收率(%) 相对标准偏差(%) α-六六六 109.4 3.5 p， p’-滴滴滴 110.1 5.2 六氯苯 90.2 2.3 o，p'-滴滴涕 96.1 1.5 β-六六六 105.3 3.7 p，p'-滴滴涕 110.2 4.7 γ-六六六 133.9 6.1 联苯菊酯 113.7 6.1 8-六六六 105.3 6.0 甲氰菊酯 106.0 4.1 艾氏剂 102.2 4.8 三氯杀螨砜 105.2 2.9 三氯杀螨醇 60.0 2.4 硫丹 110.5 3.8 七氯 93.7 8.3 功夫菊酯 142.5 11.9 p， p'-滴滴伊 113.4 3.6 氯菊酯 137.5 4.6 狄氏剂 106.1 5.2 氯氰菊酯 131.3 5.5 噻嗪酮 112.9 3.1 氰戊菊酯 128.6 4.6 异狄氏剂 111.3 5.4 溴氰菊酯 106.1 3.9 4、结论 在线GPC-GCMS 中的GPC能很好地除去植物源性食品中干扰目标化合物，如油脂、色素(叶绿素、叶黄素)、生物碱、聚合物等大分子化合物，降低实验背景、减少干扰物对待测农药的定量影响，尤其 能减少或消除油脂和聚合物等大分子化合物的干扰。但GPC对基体中的小分子物质去除能力较弱，可以在原提取净化样品的基础上，再采取一些净化措施，如PSA或 C18固相萃取来弥补 GPC的不足。 本文通过对采用实验室前处理方法和QuEChERS 方法与 GPC-GCMS 的测定研究，， 可以看出在线GPC-GCMS分析技术能对目前使用的各类农药残留分析方法进行很好的匹配，并且能在一定程度上进一步优化原有的分析结果，提高分析结果的准确性和相关质谱图匹配性。 ( 参考文献 ) ( [1]. 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