利用南京科捷高效液相色谱仪检测保健品中非法添加物西地那非

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利用南京科捷高效液相色谱仪检测保健品中非法添加物西地那非 枸橼酸西地那非(Sildenafil citrate)，它通过选择性抑制环磷酸鸟苷特异的5型磷酸二酯酶，是第一个用于治疗男性勃起功能不良(erectile dysfunction，简称ED)的药物，由于其相关的相关的不良反应，需在医生指导下使用。国家食品药品监督管理局规定所有含枸橼酸西地那非的食品均不合法。但是，往往有些厂家在保健食品中非法添加枸橼酸西地那非， 对服用者造成严重的危害。 目前，对保健食品中枸橼酸西地那非的检测有分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等。由于保健品成分复杂，基质干扰大，且非法添加的枸橼酸西地 那非含量低，因此对样品的前处理较为关键。本文采用固相萃取技术对样品进行前处理，对其中的西地那非进行富集后，应用高效液相色谱法对其进行检测，该法简单、快速、准确。 主要仪器 高效液相色谱仪（南京科捷）；超声波清洗器；氮吹仪；离心机。 试剂 枸橼酸西地那非标准品；固相萃取小柱Strata X-C 60 mg/3 mL ；乙腈；甲酸、氨水、醋酸铵；文中所用水均为超纯水。 色谱条件 色谱柱：C18 2.6 µm 50 mm x 4.6 mm； 流动相：乙腈-10 mM 醋酸铵（V/V=35/65）； 流速：1.8 mL/min； 柱温：室温； 检测波长：290 nm； 进样量：10 µL 标准溶液配制 精确称取100 mg枸橼酸西地那非标准品于100 mL容量瓶中，加入流动相50 mL使溶解，再用流动相定容至刻度，配制成1 mg/mL的储备液。取储备液适量，用流动相逐级稀释， 配制成浓度分别为0.5、5.0、10.0、20.0、40.0 、80.0 µg/mL的标准溶液。 样品处理 固体样品：称取样品10 g，研磨均匀，然后精密称取2 g研磨均匀的样品，加入1%甲酸甲醇溶液10 mL，超声提取30 min后用1%甲酸甲醇溶液补足体积，过滤，取5 mL滤液作为待净化液。 液体样品：按样品体积比1%加入甲酸，过滤，精密取滤液5 mL作为待净化液。 Strata X-C小柱依次用3 mL甲醇和3 mL水活化平衡后，将待净化液分次过该小柱，再分别用3 mL水和3 mL甲醇清洗，抽至近干后，用5%氨水甲醇溶液洗脱3次，每次1 mL，收集洗脱液。整个过程流速小于1 mL/min。洗脱液用氮气吹干，1 mL流动相溶解，0.45 µm滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。 固相萃取条件的选择 保健品中成分复杂，简单的液-液萃取并不能除去大部分杂质，会严重干扰西地那非的液相测定。Strata-X-C 是混合型阳离子交换固相萃取小柱，对碱性化合物有很强的专属选择性， 成功用于复杂样品中三聚氰胺等碱性化合物的纯化和浓缩。 西地那非为碱性化合物，本法利用其碱性性质，采用Strata-X-C对样品进行纯化和浓缩，分别使用水和甲醇清洗，除去大部分水溶性和脂溶性杂质，再用5%氨水甲醇溶液洗脱碱性的西地那非。 本固相萃取方法净化效果好，回收率稳定，平均为95.8%（20 µg/mL，RSD=3.9%，n=6）。 色谱条件的选择 本法试验了不同比例的乙腈与0.1%甲酸水溶液以及乙腈与不同浓度醋酸铵水溶液作流动相的效果，发现乙腈与10 mM醋酸铵水溶液作流动相时，峰形对称、尖锐，检测灵敏度高。 本法还采用实验室常用的紫外检测器检测，适用于一般实验室的常规检测分析。 本法使用了50 mm长的Kinetex C18色谱柱。Kinetex C18色谱柱是一种新型核-壳技术填料色谱柱,由于大大改善了填料的传质阻抗影响，可以在常规液相色谱仪器上实现超高压液相的性能， 从而达到快速、高效的效果，大大提高工作效率，且不受仪器条件的影响，方便在各个实验室进行方法转移。在流速1.8 mL/min下，西地那非在约2.5 min处出峰，没干扰。 结论 本法采用阳离子交换固相萃取小柱对样品进行净化后，进行高效液相色谱分析。固相萃取可除去样品中的大量杂质，再使用高效的液相色谱柱使枸橼酸西地那非能够快速出峰（仅约2.5 min）而不会受杂质峰干扰。 该方法操作简单，省时快速，精密度和准确度高，可用于片剂、胶囊剂、丸剂等固体保健品和口服液、酒类等液体保健品中枸橼酸西地那非的检测。 附：南京科捷高效液相色谱仪简介 等度配置 P600高压恒流泵  1台 UV600紫外检测器  1台 7725i六通进样阀  1支 进口C18柱 150×4.6mm,5μm 1根 WS600色谱工作站  1套   仪器特性 LC-P600型高压恒流泵 ☆ 采用微处理器智能控制，稳定可靠，操控精密。 LC-P600高压恒流泵是微处理器智能控制的往复式双柱塞并联泵，具有工作压力高、脉动小、稳定可靠、操作方便等特点。其机械组件由电脑辅助设计，各主要零部件均在世界先进的数控加工中心制造，因此具有加工精确度高、泵体密封性能好、零件的互换性好等特点。 柱塞杆采用浮动导向结构，驱动凸轮由高强度合金钢制造。采用微处理器控制微步驱动电路，使得驱动泵的步进电机运行平稳、噪声低、速度调节范围大。LC-P600高压恒流泵在压力为0～42Mpa的范围内，流量可以从0.001mL/min开始到9.999mL/min。这样满足了常规分析到微流量分析的需要。   ☆ 设置参数方便 在单泵等度分析时，可根据该仪器上全汉字显示液晶屏的提示语句，通过四个功能键就可变换各种操作模式，并且可以方便地设置流量、压力上下限、持续工作时间、压力单位等参数。   ☆ 具有过程监测功能 LC-P600高压恒流泵具有过程监测功能。微处理器实时控制泵的流量和检测输液压力。在压力超限的情况下，报警并自动停止泵的运行。   ☆ 工作站可控制多台泵的运行 可采用LC-WS600工作站，通过RS232接口，控制多达四台泵的运行，建立多元梯度分析系统。   ☆ 采用模块化设计 LC-P600高压恒流泵整体结构采用模块化设计，包括机械部分和电路部分都可以独立装拆，因此故障检查和调换都非常方便。 LC-P600高压恒流泵采用双柱塞并联泵结构，双泵头交替输液。在同样输液量的情况下，它的输出脉动要比串联泵低得多，而活塞杆和密封圈寿命要比常规串联泵长一倍。   LC-UV600型紫外检测器 ☆ 采用平行双锥孔流通池，降低仪器噪音和信号漂移 LC-UV600紫外检测器采用了平行的双锥孔流通池，样品池和参照池完全处于对等的条件。锥孔设计的流通池，可以在同样的池体积情况下，提高通过池孔的光能量，明显降低了仪器的静态噪音和信号漂移。   ☆ 光路系统更为精密 光路系统采用了精密定位结构，所以精度高、偏移小。氘灯座和光路系统采用热隔离安装技术，降低了仪器的稳定时间，并且使氘灯的发热对光路系统的影响降到最低。   ☆ 控制电路采用多微处理器结构 控制电路采用多微处理器结构，分别管理信号采集、数据处理、系统控制和通信。LC-UV600紫外检测器在做等度分析时，可以方便地通过全汉字的液晶屏与七个功能键，设置紫外光波长、滤波常数、输出量程、运行时间等参数。并且可以实现开关氘灯、光谱扫描、启动分析程序等功能。   ☆ 独特地使用了数字信号直接输出的线路结构 LC-UV600紫外检测器独特地使用了数字信号直接输出的线路结构。相比以往的紫外检测器色谱信号大多数采用模拟信号输出或者是内部数字信号处理后，再转换成模拟信号输出到色谱数据处理装置，然后再经过模数转换。这样多重的转换势必导致信号畸变和干扰。而LC-UV600紫外检测器通过RS232接口将数字化信号毫无损失地送到LC-WS600工作站进行对数转换和积分处理。   ☆ 工作站设计更为功能化 LC-UV600紫外检测器可以通过LC-WS600工作站上的图形化界面，方便地实现控制氘灯开关、光谱扫描、继电器开关、波长扫描等功能。   LC-WS600色谱工作站 ☆ 具有控制和处理双重功能 LC-WS600色谱工作站具有双重功能：控制LC-600A液相色谱系统和色谱数据处理。 1）控制功能：通过和LC-UV600紫外检测器之间的RS232通信电缆，在图形化界面下同时控制可多达四台的LC-P600的高压恒流泵及LC-UV600紫外检测器，实现多元高压梯度洗脱和波长扫描等功能。可以显示各台泵的流量、压力、分析的时间曲线和波长扫描曲线等。 2）色谱数据处理：接受LC-UV600紫外检测器送来的数字信号，直接进行数据处理。   ☆ 具有多样化的基本功能 1）六种定量计算方法：归一法、修正归一法、带比例因子的修正归一法、内标法、外标法及指数计算法。 2）校准运行：能够实现使用多种不同浓度的标准试样进行校准，建立样品浓度──面积校正曲线。 3）灵活的峰识别和处理能力：可以通过设置峰处理参数和时间程序识别色谱峰的处理，也可以用人工方式进行处理。 4）色谱图形、设定的定量计算方式、峰处理参数及峰鉴定表等可以保存到用户自命名的文件中。