蛋白质药物单克隆抗体中肽段检测方案(液质联用仪)

智能文字提取功能测试中

Average Structural Resolution = 1.1 residuesThermoFisherSCIENTIFIC赛默飞世尔科技(中国)有限公司免费服务热线：8008105118 400 6505118(支持手机用户)客服邮箱： sales.china@thermofisher.com PepFinder 软件对单克隆抗体进行肽图分析张晓夕1， Sutton， Jennifer N.’ 1赛默飞世尔科技(中国)有限公司 2 Thermo Fisher Scientific， West Palm Beach， FL， USA 1前言 在蛋白质药物产品的质控要求中，肽图分析是其中重要的一环。肽图分析包括对蛋白氨基酸序列进行确证及相关修饰的鉴定和定量。根据蛋白药物质谱分析特点和生物制药应用的特殊需求， Thermo Fisher 与 Amgen 联合开发了 PepFinderM软件。 PepFinder 不仅具有最基本的肽段序列确证、覆盖率分析、修饰位点鉴定与定量、 二硫键分析、图谱对比和肽段 CID/HCD/ETD 谱图解析等功能，还具有其独特功能，如未知修饰搜索功能和氨基酸突变搜索功能1-5)。这两项功能可以帮助分析人员快速发现可能出现的序列突变，从而大大降低出现质量风险的几率。同时， PepFinder 还有更多实用的功能设计，如内置 CHO细胞系糖型、具有肽段鉴定可信度评价功能，还可根据碎裂方式和能量智能预测多肽的理论碎裂谱图，并用于与实验图谱直观对比，以辅助分析。这些功能不但减少工作强度，也降低了对分析员理解质谱数据深度的要求。对于氨基酸固定修饰设置，不同于其它类似软件(固定修饰只可精确至某一类氨基酸)，在 PepFinder 中，可以精确到特定的某个氨基酸位点。此功能对于蛋白药的某些特殊分析需求提供了极大的便利。 图1显示了 PepFinder 搜库得到的序列覆盖度结果，图中不同颜色代表信号强度。从图中可以看出，单抗标准品的轻重链覆盖度均达到了100%； PepFinder 还可对脱酰胺进行定量，这对于生物医药分析人员是非常有用的。图2显示了PepFinder 生成的修饰情况总结；图3展示了一条包含脱酷胺修饰肽段 SNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEK 的定性以及定量情况。 2.2 PepFinder2.0新增功能 在 PepFinder 软件的2.0版本中，加入了 De Novo ( 从头测序，指对于没有蛋白序列的物种，根据质谱碎片信息利用生物信息学计算，对序列重新拼接和组装，以得到蛋白序列的技术)功能，可对所有肽段进行 De Novo Sequencing(图4)，或单独对某一张 MS/MS 谱图对应的肽段进行 De NovoSequencing(图5)。 在PepFinder2.0软件中，新增了 mgf 格式文件输出功能，供 MASCOT 用户进行 HCP分析；还新增了 Pinpoint txt 文件输出功能， 供 Pinpoint 用户进行蛋白绝对定量；方便生物制药用户使用不同软件对数据进行深度分析，大大减少工作人员在数据处理上耗费的时间和精力。 从图3中可以看出，使用 PepFinder 软件可获得连续的肽段碎片离子，提高了鉴定结果的可靠性；分别对 N416 和N429两个可能发生脱酰胺修饰的位点进行定量，可以得到N416的脱酰胺比例为2.28%， N429的脱先胺比例为2.90%。对于生物医药行业分析人员，脱酰胺修饰量的变化是药物稳定性测试的重要参数， PepFinder 软件可提供精确到位点的脱酰胺定量信息，为分析人员提供有力参考。 3 PepFinder 独有功能介绍 在PepFinder软件中，只要导入单克隆抗体的序列，即可自动计算出该抗体的重链末端K丢失后分子量、还原后(未还原)轻/重链分子量、无糖/脱糖重链分子量和各种常见糖型重链分子量等(图6)；目前，此功能为 PepFinder 软件独有，其他类似软件尚无此功能。 PepFinder 软件还可对二级谱图进行预测，在类似软件中， PepFinder 软件预测得到的二级谱图最接近真实碎裂的谱图(图7)。 rAhza 图1PepFinder 序列覆盖度结果 Datz File=QE_exzmple_mAbrawProtease=Trypsin Protein Modifcation RecoenAbundancemAb Lizht chain M4+Oxidatiom (Good13654%mAb Linht chzin Q5+Dosmidatiom Good2.5030%mAb Light chain~N33+Dezmidation Good 1.0104%mAb Light chainN5S+Doamidatiom Fair 100.0000%mAbLirht chain Q95+Daamidation Good 2.1878%mAb Light chzinN162+Deamidation Good21.0524%mAb Lizht chzinN165+Doxmidaticm Good 0.6312%mAb Lizht chainM1S0+Oxidatiom Good15127%mAb Light chzin N195+Dosmidation Good12562%mAbLizht chzin~N217+Dezmidation Poor100.0000%mAb Heavy chainQ16+Doamidatiom Good2.9566%mAb Heasy chain ~49+Oxidation Good0.7255%mAb Heasy chain Q77+Doamidatiom Good 12996%mAb Heauy chain MS2+Oxidatiom Good0.8678%mAb Heauy chainNS3+Doamidation Good15524%mAb Heavy chainQS6+Doamidation Good 1.7314%mAb Hosuy chainQ136+DoamidationGood0.4355%mAb Heaty chzin~Q269+Demidation Good 0.6076%mAb Heauy chain N292-A1G0F Good 6.7433%mAb Heauy chain N292+A1G1F (Good1.8260%mAb Hesvy chzin N292+A2G0 Good 12300%mAb Heavy chzi N292-A2G0F Good40.65049HAbHoay chai N292+A2G1 Good0.3103%N292-A2G1F Good39.1835%mAb Heavy chi N292-A2G2F Good8.0776%mAb Heauy chain N292+A2G2M4F Good1.0406%mAb Heavy chai N291+A2G2M5F Good0.5199%mAbHoauy chainN292-Uzabcosylate：Good 0.3559%mAb Hoavy chain M304+Oxidatiom Good 5.6165%mAb Hoavy chzinQ305+Deamidation Good0.5530%mAb Heasy chainN310+Desmidaticn Good3.5703%mAbHoavy chainN319+Demidation Good0.9416%mAbHeasy chainQ390+Desmidation Good12065%mAb Hoavychain M393+Oxidation Good3.0349%mAbHoasy chzinN405+Doxmidation Good 0.2954%mAb Hoauy chainQ40S+Desmidatiom Good 1.5056%Ab Hoy chai1W412+Oxidation Good 0.3810%mAb Heauy chain~N416+Doamidation Good 1.4621%mAb Heavy chsinFN429+DesmidationGood1.7589% mAb Light chain M180+Oxidation Good 1.5127% mAb Light chain N195+Deamidation Good 1.2562% mAb Light chain ~N217+Deamidation Poor 100.0000% mAb Heavy chain Q16+Deamidation Good 2.9566% mAb Heavy chain ~M49+Oxidation Good 0.7255% mAb Heavy chain Q77+Deamidation Good 1.2996% mAb Heavy chain M82+Oxidation Good 0.8678% mAb Heavy chain N83+Deamidation Good 1.5524% mAb Heavy chain Q86+Deamidation Good 1.7314% mAb Heavy chain Q136+Deamidation Good 0.4355% mAb Heavy chain F-Q269+Deamidation Good 0.6076% mAb Heavy chain N292+A1G0F Good 6.7433% mAb Heavy chain N292+A1G1F Good 1.8260% mAb Heavy chain N292+A2G0 Good 1.2300% mAb Heavy chain N292+A2G0F Good 40.6604% mAb Heavy chain N292+A2G1 Good 0.3103% mAb Heavy chain N292+A2G1F Good 39.1835% mAb Heavy chain N292+A2G2F Good 8.0776% 图 2 PepFinder 生成的修饰情况总结 Average Structural Resolution = 1.1 residues 图3肽段 SNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEK的脱酰胺鉴定及定量 图4在 PepFinder2.0 中对所有肽段进行 De Novo Sequencing 图5对一张 MS/MS 谱图进行 De Novo Sequencing 图6在 PepFinder 软件中计算单克隆抗体各种常用分子量 图7 PepFinder 软件预测的二级谱图与实测二级谱图的对比。上，预测二级谱图；下，实测二级谱图。 4结论 在本文中，我们展示了 PepFinder 软件对单克隆抗体进行常规肽图分析的各种应用。结果表明，使用PepFinder软件可以简便快捷的得到序列覆盖度分析的结果，并且可以对脱酰胺等生物医药质控中重要的翻译后修饰进行鉴定以及定量。PepFinder 独具的单克隆抗体分子量计算功能及二级谱图智能预测功能大大减少了分析人员花费在数据处理上的时间；在PepFinder2.0版本中，新增的 De Novo Sequencing 功能和mgf 格式文件、pinpoint txt 文件输出功能帮助分析人员对数据进行不同平台上的深入挖掘。通过生成快速、全面的肽段表征及自动化的修饰位点总结报告， PepFinder 软件能够大幅减少生物产品详细表征所需的时间和精力。 ( 1. Z. Zhang， Automated P r ecursor Ion Exclusion During LC/MS/MS Data Acquisition fo r Optimal Io n Id e ntification， J.Am. Soc. Mass Spectrom. 2012，23(8)，1400-1407. ) ( 2. Z. Zhang， Large-scale Identification and Quantificationof Covalent Modifications in T h erapeutic Proteins. Anal.Chem.2009，8 1 (20)，8354-8364. ) ( 3. Z. Zhang a nd J. S . M celvain， O ptimizing spectroscopicsignal-to-noise ratio i n a nalysis of data collected by achromatographic /spectroscopic system， Anal. C hem.1999，71(1)，39-45. ) ( 4 . Z. Zhang a nd A. G. Marshall， A u n iversal algorithm for fas t and automated charge state deconvolution ofelectrospray-to-charge ratio spectra， J . Am. Soc. MassSpectrom.1998，9， 225-233. ) ( 5. Z. Zhang， Retention time alignment of LC/MS databy a divide-and-conquer a lgorithm， J. Am.Soc. Mass Spectrom. 2012，23(4)， 764-772. ) ( 6. SC. Kim， Y . Chen， S. Mi r za， et.al. A cl e an， mo r e efficient method for in-solution d igestion of protein mixtureswithout detergent or urea. J Proteome Res. 2006 Dec；5(12)：3446-52. ) PepFinder软件对单克隆抗体进行常规肽图分析的各种应用。结果表明，使用PepFinder软件可以简便快捷的得到序列覆盖度分析的结果，并且可以对脱酰胺等生物医药质控中重要的翻译后修饰进行鉴定以及定量。PepFinder独具的单克隆抗体分子量计算功能及二级谱图智能预测功能大大减少了分析人员花费在数据处理上的时间；在PepFinder2.0版本中，新增的De Novo Sequencing功能和mgf格式文件、pinpoint txt文件输出功能帮助分析人员对数据进行不同平台上的深入挖掘。通过生成快速、全面的肽段表征及自动化的修饰位点总结报告， PepFinder 软件能够大幅减少生物产品详细表征所需的时间和精力。