化学药中主要物质含量分析检测方案

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刘绿叶金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 基因毒性；高效液相色谱；液质联用；药典方法目的 按照药典方法的要求，利用液相色谱质谱仪检测甲磺酸伊马替尼片中杂质F的含量，分析与验证该方法的可行性，使其达到药典规定的要求。 引言 基因毒性杂质是指能直接或间接损伤细胞DNA，产生致突变和致癌作用的物质。常用的 图1.甲磺酸伊马替尼 材料与方法 缩写：PGLs (potentially genotoxic impurities 有潜在基因毒性 仪器和设备 的杂质)或 GTLs (genotoxic impurities 基因毒性杂质)。常见的基因毒性物质有：甲磺酸烷基酯，如甲磺酸甲酯(MMS)和甲磺酸乙酯(EMS)；在以羟乙基磺酸盐，苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐形式存在的药物活性成分中也会发现类似的磺酸烷基酯或芳基酯污染。 高效液相色谱仪 (Thermo Scientific Dionex Ultimate LPG 3400系列，包括有带在线脱气单元的四元梯度泵，自动进样器，柱温箱) 单四极杆质谱仪(MSQ Plus， Thermo Scientific) 超纯水机 (GenPure Pro UV-TOC， Thermo Scientific) 甲磺酸伊马替尼片(结构式见图1)，化学名称：4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]-苯胺甲磺酸盐，适应症为治疗费城染色体阳性的慢性髓性白血病(Ph+CML)的慢性期、加速期或急变期；用于治疗不能切除或发生转移的恶性胃肠道间质肿瘤 (GIST)的成人患者。在该药合成过程中，会产生基因杂质F，本方法按照EP规定， 采用LCMS对某制药公司提供的样品进行了分析测定，对相关药物分析研发人员有一定的参考意义。 试剂和对照品 ( 甲醇(色 谱 纯， Fisher Chemical， P/N：A452-4) ) ( 乙腈(色 谱 纯， Fisher Chemical， P/N：A998-4) ) 甲酸铵(色谱纯， Fisher Chemical， P/N：E195-4) 供试品(编号：2014001、2014002、2014003)和杂质F对照品均为某制药企业提供。 对照品与样品溶液制备 供试品与对照品配制用的溶用： ACN：H20=30：70供试品溶液配制：准确称取50.0mg 供试品，用溶剂定容至10.0mL。 杂质F对照溶液(a)：准确称取 2.0mg对照品，用溶剂定容至100mL，然后再取1.0mL，稀释至200mL，浓度为100ng/mL。 色谱与质谱条件 杂质F对照照液(b)：取5.0mL对照溶液a，用溶剂定容至10.0mL， 浓度为 50ng/mL。 分析柱： Acclaim C18，150×3.0mm， 3.0pm， P/N： 063691 S/N：00404流动相： A：1.26g/L 甲酸铵(pH3.4)B：0.5mL/L 甲酸 /ACN；梯度洗脱： 0-6min， B保持 20%； 10min， B升至80%，再保持 5min。 杂质F对照溶液(c)：取1.0mL对照溶液b，用溶剂定容至5.0mL，浓度为 10ng/mL。 流速：0.50 mL/min。 进样量：10pL 杂质F对照溶液(d)：取2.5mL 对照溶液c，用溶剂定容至5.0mL， 浓度为 5ng/mL。 柱温：40℃ 质谱检测器： ESI(+)，SIM Mode， M/Z=278.2； Gas Temp. 400℃， Voltage：3.0KV， Cone Volt. 70v 对照品色谱图(杂质F：100 ng/mL) 图2.杂质F对照品谱图 以测得峰面积为纵坐标(Y)，对应的对照品浓度为横坐标()，绘制标准曲线。杂质F回归方程分别：Y=280.07X+341.98，相关系数r=99.9% 方法重现性分析 按照以上色谱质谱条件，对照品溶液(C)连续进样6针，分析结结果如下： 表1.对照品重现性分析结果(浓度为10ng/mL，n=6) Sample No. Target Name Ren. Time Area /Counts*min /min 杂质F 9.713 4419.75 2 杂质F 9.696 4497.90 3 杂质F 9.696 4811.41 4 杂质F 9.730 4639.56 5 杂质F 9.696 4403.76 6 杂质F 9.693 4303.76 Rel.Std.Dev： 0.15% 3.7% 从以上表可以看出，重现性较好，峰面积值 RSD 在5.0%以内，小于EP 要求的10%，满足方法要求。 方法检出限 按照 EP方法要求，对杂质F对照溶液(d) 5.0ng/mL 进行了分析，根据峰高计算其信噪比(S/N)为25，大于10，满足方法要求。 样品加标分析结果 称取1份实际样品(编号：2014003)，进行加标分析，结果表明：样品实际值 112.3 ng/mL， 加入值 100 ng/mL，理论值为212.3ng/mL，实测值214.3ng/mL，因此，杂质Ｆ回收率为100.9%，回收率较好。 样品分析谱图与结果 图3.实际样品分析图 表2.样品分析结果 Sample No. Target Name Ren. Time Amount /min /ng/mL 2014001 杂质F 9.713 101.5 2014002 杂质F 9.662 29.21 2014003 杂质F 9.713 112.3 按照 EP的方法规定，对甲磺酸伊马替尼片中杂质F进行 ThermoFisherSCIENTIFIC AN_C_LC-