肉制品中农兽药残留检测方案

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Agilent 6410 串联四极质谱检测食品中的孔雀石绿和隐性孔雀石绿 利用安捷伦高效液相色谱6410/串联质谱(LC/MS/MS)方法快速、准确地测定孔雀石绿(MG)和隐性孔雀石绿(LMG)的残留量。串联质谱在电喷雾(ESI+)，多反应监测(MRM)模式下，进行质谱定性和定量分析，无需采用传统的 PbO，氧化柱，比液相检测方法灵敏、快速。该方法的定量限(LOQ)为0.01 og/kg，完全可以达到出口欧盟和日本残留限量的要求。 1概述 孔雀石绿 (C23H2sCIN，)为金属光泽的结晶体，极易溶于水，水溶液呈蓝绿色。它可用作杀菌、驱虫剂，是药用染料中抗菌效力较强的一类，属于三苯甲烷类染料。一般用于鱼类防治水霉病、烂鳃病以及寄生虫病等。 孔雀石绿具有潜在的致癌性，美国、日本以及英国等许多国家已禁止用于水产养殖业。中华人民共和国农业行业标准无公害食品渔用药物使用准则(NY5071-2002)中已将孔雀石绿列为禁用药物。由于孔雀石绿在水产养殖业中抗菌效果较好、价格低廉，宣传力度不够等原因，使得不少用户还在小范围使用，因此对于孔雀石绿的监控就显得格外重要。近 几年我国因药物残留出口的动物性食品屡遭禁运。欧盟派到中国的专家组，曾多次强烈要求中国政府对孔雀石绿残留进行监控。本文在已有的方法基础上改进了仪器方法{1，2，3]，利用 Agilent 6410 串联质谱同时测定孔雀石绿和隐性孔雀石绿。实验证明该方法快速、简单，灵敏度高，完全达到了出口欧盟和日本的检测要求。 2试剂 2.1试剂 孔雀石绿标准品购买于 Sigma-Aldrich公司(CAS 569-64-2， USA)，隐性孔雀石绿购买于 Dr.Ehreastorfer 实验室(纯度99%，D-86199 Augsburg，Germany)，化合物的结构见 Fig 1。乙腈购买于Burdick & Jackson 公司 (CAS 75-05-8， Muskegon，USA)， 乙酸购买于 Merck 公司 (Germany)，乙酸铵购买于 Acros Organics 公司 (CAS 631-61-8，NewJersey， USA)。水为 Milli Q。 准确称取适量的孔雀石绿和隐色孔雀石绿，用乙腈分别配制成100 g/mL的标准贮备液，-18℃避光保存。使用前，用乙乙/水=50：50的溶液稀释至所需要的浓度。 图1.孔雀石绿和隐性孔雀石绿的结构 实际样品的前处理参见国标 GB/T 19857-2005。 2.2液相条件 采用 Agilent 1100 系列的液相色谱仪，配置有G1379A 脱气机， G1311A 四元泵， G1367A 自动进样器， G1314紫外检测器。色谱柱： Inertsil ODS-3，2.1×150 mm，5om。流动相组成：A为10mmol/L乙酸铵水溶液(用乙酸调节pH值4.5)，B为乙腈溶剂。流速 0.3 mL/min，柱温40℃。梯度条件为： 2.3质谱条件 Agilent 6410 串联四极杆质谱仪，配置了 ESI 离子源。在(+)ESI 模式下，采集数据，设定质谱参数如下： Capillary 4000 V， Drying Gas 11 L/min，Neb Press 35 psi， Gas Temp 350℃， Fragmentor90， Skimmer 15， OctDc1 (Skim2) 45V， Oct RF500V，碰撞气为高纯氮气，Q1和Q3的分辨率均为单位质量分辨。MRM 模式下的参数如下： 表1.液相色谱梯度条件 Time A相 B相 0 70 30 50 50 5 95 8 95 8.01 70 30 13 70 30 表2. MRM模式下的质谱参数 Time Compound Precursor Product Dwell (ms) Fragmentor Collision Engergy (V) (V) 孔雀石绿 329.3 313.3 40 100 40 329.3 208.2 40 100 40 7 隐性孔雀石绿 331.3 316.3 40 100 30 331.3 239.2 40 100 30 3结果和讨论 3.1化合物的质谱参数优化 孔雀石绿在保留时间5.5分钟左右，隐形孔雀石绿在保留时间8.3分钟左右。 不同碰撞能量条件下，孔雀石绿和隐性孔雀石绿的 MS/MS 谱。孔雀石绿和隐性孔雀石绿由于结构上的差异，各自产生碎片离子所需要的碰撞能量都不相同。对于孔雀石绿而言，碰撞能量为40V时，发生裂解反应，得到最大离子强度的碎片离子。孔雀石绿丢失一个甲基离子得到了 m/z 313离子，或者丢失一一 N，N-2甲基苯胺得到了 m/z 208 离子。对于隐性孔雀石绿，碰撞能量为30Ⅴ时，发生裂解反应，得到最大离子强度的碎片离子。隐性孔雀石绿丢失一个甲基离子得到 m/z 316 离子，然后继续丢失一个苯离子生成 m/z 239 离子。 3.2标准曲线和线性范围 用乙腈/乙酸铵缓冲液=50：50的溶液配制成 相当于浓度为10，50，100，500，1000，5000，10000fg/oL的孔雀石绿和隐性孔雀石绿混合样品的系列标准溶液。按照前面的方法进行 LC/MS/MS 分析，建立标准曲线。以待测物质浓度(C)为横坐标，待测物的质谱峰氧积(Y)为纵坐标，忽略原点且无权重因子进行回归计算，求得的直线回归方程即为标准曲线。孔雀石绿的直线回归方程为Y=23363.3374X-1766.9951，相关系数 R2 为0.999461，线性范围为100~100000 fg， 最低定量浓度为 10 fg/ocL，色谱图见Fig 3-a。隐性孔雀石绿的直线回归方程为Y=93199.4712X-7543.3588，相关系数R2为0.999426，线性范围为100~100000 fg，最低定量浓度为10 fg/L， 色谱图见 Fig 3-b。 图3.孔雀石绿以及隐性孔雀石绿的校准曲线 3.3方法的精密度和准确度 用乙腈/乙酸铵缓冲液=50：50的溶液配制成相当于浓度为100 fg/cL 的孔雀石绿和隐性孔雀石绿混合物待测样品，进行 LC/MS/MS分析，每一浓度进行8样本分析，所得的 RSD 孔雀石绿是3.52%(S/N>20)，隐性孔雀石绿是2.25%(S/N>40)。 3.4实际应用 根据中华人民共和国国家标准 GB/T19857-2005中有关水产品的前处理方法，实际添加了 100 ppt的孔雀石绿和隐性孔雀石绿样品，经萃取、净化等步骤，最后测得的质谱图见 Fig 4。 Fig 4. 添加了 100 ppt 的孔雀石绿和隐性孔雀石绿样品测得的质谱图 4结论 利用安捷伦6410串串质谱(LC/MS/MS)方法可以快速、准确地测定孔雀石绿和隐性孔雀石绿的残留量，完全可以达到出口欧盟和日本残留限量的要求。有文献报道利用 APCI 进行该类化合物的测定[4]，可以在今后的实验中进行比较。 5致谢 感谢北京市海淀区质量监督检验所刘艳琴博士提供了隐性孔雀石绿的标准品以及完成了实际样品前处理。 ( 1.中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局国家标准化管理委员会，水产品中孔雀石绿和结晶紫 残留量的测定， GB/T19857-2005，2005； ) ( 2. K. Halme， E . Lindofors， K . P eltonen. FoodAdditives and Contaminants.21 (7)，641； ) ( 3. Aldert A. Bergwerff. Peter Scherpenisse. J. Chromatogr B. 788(2003)，351； ) ( 4. Luis Valle， Cecilia Diaz， Antonio L Zanocco etc.J. Chromatogr.A. 1067(2005)，101 )