乳制品及特殊膳食中添加及非法添加检测方案

智能文字提取功能测试中

结果与讨论 4SCIENTIFICAN_C_GCMS-38 刘茜余天赛默飞世尔科技(中国)有限公司 对于 GCMS 测定三聚氰酸及三聚氰胺，如果采用直接上样法，目标物峰形成较大的馒头峰，且灵敏度较差，因此此物质在 GCMS 上分析要将其进行衍生化。对于衍生化后的最佳溶剂介质为吡啶。本方法采用 Triplus-RSH自动前处理样品平台来实现三聚氰胺的整个衍生化过程，可以减少实验人员在衍生化过程中和溶剂的接触，衍生化完成后能够直接在该平台上实现自动化进样，减少样品转移过程中潜在发生的误差。是一种通量高，节省人力的方法。本文了利用 Triplus-RSH 自动前处理样品平台结合 GC-MS 对奶样品中三聚氰酸、三聚氰胺的方法进行分析，方法快速、安全，可完全满足奶制品安全检测的要求。 仪器Thermo ScientificTM DionexTM ChromeleonTM version 7.2Thermo Scientific M Trace 1310-ISQ， SSL 进样口Thermo ScientificM Triplus RSH 三合一自动样品前处理平台 色谱柱： TG-5MS，30 m， 0.25 mm， 0.25 pm P/N： 26098-1420；S/N： 1081026 ·进样针：10pL，1000pl 试剂与标准品耗材 Thermo scientific HyperSep Retain CX SPE 柱 (500mg，6mL)，HPLC级甲醇， BSTFA+1%三甲基氯硅烷 (TMCS)，吡啶，三氯乙酸，乙酸铅，乙腈，无水硫酸钠，氨水。 仪器方法 进样口温度：250℃；进样模式： splitless；进样体积： 1pL。柱温：：100℃(1min)， 10℃ /min 到 210℃ (3min)，500℃ /min 到300℃ (2min) 离子源：温度280℃， Transfer line ： 280℃ 扫描参数： 1、全扫描(Scan) ： 45-350 2、SIM模式：Time-SIM， 9.69 处扫描离子73，147，330，345；12.65处扫描离子99，171，327，342. 奶制品中的三聚氰胺、三聚氰酸采用三氯乙酸、乙腈溶液提取，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，采用BSTFA+1%三甲基氯硅烷 (TMCS)衍生，以 GCMS进行定性定量。 溶液配制 标准溶液：取三聚氰胺、三聚氰酸标准品 0.05g溶于50mL甲醇溶液中，配制成1000 ug/mL 的标准储备液。 标准工作液：取以上两种标准储备液稀释至0.005 pg/mL、0.01 pg/mL、0.05 pg/mL、0.1 pg/mL、0.5 pg/mL、1.0 pg/mL。 提取： 称取乳制品5.0g于塑料离心管中，准确加入15mL三氯乙酸(10g/L)、5mL乙腈，再加入2mL乙酸铅溶液(22g/L)，涡旋混匀，充分振荡。以 10000 r/min 速度离心15 min， 取上清液待用。 净化： 分别用3mL甲醇，3mL水和3mL甲醇活化 Retain CX SPE 柱(6mL500mg)固相萃取柱，准确移取10mL离心上清液依次上固相萃取小柱。以3mL水和3mL甲醇洗涤，抽近干后用氨化甲醇(5mL氨水溶于100 mL甲醇)3mL洗脱，收集洗脱液，洗脱液过无水硫酸钠备用。 洗脱液于55℃氮气吹至近干，待衍生后进 GCMS 进行定性定量分析。 三聚氰胺、三聚氰酸的衍生 本实验采用 Triplus RSH 进行在线衍生，所需配置见下表 表2.所需配置 Automatic tool changer Syringe tool D8 (1000 pL used for dilutions) agitator (for vial mixing and incubation before injections) Standard washing station (2x10 mL)(for the derivatization reagent source location) Tray holder Vial tray VT54 (3 pcs， for 2 mL vials) Vial tray VT70 ( for 20 mL vials) (for the derivatization agent source location) Cooled tray recommended if the lab temperature above 25 C 自动衍生化 本实验要求对标准品和样品中的三聚氰胺、三聚氰酸进行衍生化再进 GCMS 进行分析，本方案采用 Triplus RSH进行自动衍生化。 衍生化步骤主要包含三步，首先将衍生化试剂加入待衍生小瓶；将衍生介质加入待衍生小瓶；将小瓶放置于孵化炉进行衍生化，时间30 min；最后取出小瓶冷却至室温 25℃后进样分析。 如下为所需衍生实验的放置情况： ( .1 配有磁性盖的2mL进样小瓶(放置在进样盘处，做为衍生化发生装置) ) ( 2. 衍生化化剂(BSTFA+1%TMCS)放置在标准洗针液处(根据实验要求所需衍生化试剂量放置衍生化试剂位置，因为衍生化试剂较昂贵，本实验每次衍生化所需体积200uL，标准品+样品共12个，所需体积2.4mL， 因此置于标准洗针液处) ) 3 衍生化介质(吡啶)放置在VT70 样品盘中的20mL顶空瓶中(根据实验要求，每次消耗衍生介质600 pl，12样品共计7.2mL) 衍生过程： 将以上处理氮吹近干的2mL样品瓶放置在样品盘上，以D8 tool (1000pL) 移取 200 pL衍生化试剂至样品瓶， 再以D8 tool 移取 600 pL吡啶至样品瓶。Triplus RSH 将该小瓶转移至孵化炉(70℃)， 完成 30min 衍生化，完成衍生后将样品瓶取出，此时气相做一针虚拟进样，根据需要可将该虚拟进样时间自己设置，因本实验要求衍生化后冷却至室温(如配有冷却装置可将该时间减至1 min)后再进样，本实验选择将 GC 时间设置为 10 min。 1.样品提取条件的选择 本实验中的样品基质为牛奶，牛奶样品的特点极易形成混浊液，因此本方法采用三氟乙酸-乙腈来进行提取，以达到沉淀蛋白的目的，同时实验中考察了仅用乙腈和仅用三氟乙酸来提取，实验效果表明当采用二者混合时提取效率最高，另外其中加入乙酸铅也是有利于牛奶中蛋白的沉淀作用。 本方法采用Retain CX 固相萃取小柱对牛奶样品进行净化，采用阳离子交换固相萃取小柱可以达到最大程度的净化除杂，净化后采用氨化甲醇洗脱，洗脱体积3mL可达到最佳的洗脱效果。 2.衍生条件的选择 本实验中对待测物的衍生化需注意，实验中采用40℃甲 醇溶解三聚氰胺、三聚氰酸，因此在衍生前要求将溶解的甲醇全部吹干，否则将影响三聚氰胺的衍生化产率。另外，注意实验用小瓶在使用前经烘箱烘烤 10 min 以保证其不含有水分，水的存在对衍生的结果至关重要，衍生化试剂遇水将导致其失去衍生化功能。实验考察了衍生化温度50℃、60℃、70℃、80℃，实验结果表明，当选择温度为70℃时，此时的衍生化效果最好，另外温度过高，易有部分溶剂汽化，因此本方法采用衍生化温度70℃。 3.标准品色谱图及样品加标色谱图 其中图1为标准品直接衍生后的 TIC色谱图，图2为衍生后的质谱图。图4为标准品、样品加品及样品的T-SIM谱图，图5-图12为标品、样品加标中三聚氰酸、三聚氰胺的提取定性、定量离子比较谱普。 图1.2.0 pg/mL三聚氰胺、三聚氰酸标准品的 TIC 色谱图，其中 9.680处为三聚氰酸、12.650处为三聚氰胺 Melamine Scan： #2541 RT： 12.64 min NL： 4.93... 图4.标准、样品加标、样品 Time-SIM谱图；其中9.68处为三聚氰酸、12.64处为三聚氰胺 图5.标品、样品加标提取定量离子73的对比图 图6.标品、样品加标提取定性离子330的对比图 图7.标品、样品加标提取定性离子147的对比图 图8.标品、样品加标提取定性离子345的对比图 以上四图为标品、样品加标中三聚氰酸的定性、定量离子比较图。 图9.标品、样品加标提取定量离子327 的对比图 图 11.标品、样品加标提取定性离子171的对比图 图10.标品、样品加标提取定性离子342的对比图 图12.标品、样品加标提取定性离子99的对比图 4.线性、检出限及RSD 配制浓度分别为： 0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 ug/mL的校准溶液，采用上述方法分别进样分析，考察各组分在0.005-1.0 pg/mL 浓度范围内的线性。实验结果表明三聚氰胺、三聚氰酸在 0.005-1.0 pg/mL 线性关系良好，线性相关系数大于0.999(见图13)。 对某牛奶样品添加标准溶液(加标浓度为8.0 pg/kg、80.0 g/kg)，考察三聚氰酸、三聚氰胺的加标回收情况。实验结果表明加标回收率在68%-85%，符合日常分析检测的要求。对8.0、80.0 pg/kg 加标水平平行测定5次，平均 RSD 值为4.9%、8.3%，符合稳定性要求。同时以三倍信噪比计算检出限，仪器检出器在0.001 pg/mL(见表3)。 图13.三聚氰酸、三聚氰胺衍生后产物的标准曲线 表3.线性、检出限及RSD数据(n=3) 化合物 线性方程 R/%0.02 加标 (ug/kg)回收率/% 仪器检出限/pg/L 方法检出限/ug/kg 8.0 80.0 三聚氰酸 Y=-87818.3+18124441.5*X 0.9994 68.3 80.2 1.0 8.0 三聚氰胺 Y=-93818.3+13125541.7*X 0.9990 73.4 85.2 0.8 5.0 总结 本实验采用赛默飞世尔科技 Triplus RSH三合一自动样品前处理平台结合1310GC 配 ISO质谱检测器分析奶制品中的的三聚氰胺、：三聚氰酸，样品通过 Triplus RSH 在线自动衍生通过气相色谱质谱进行定性定量分析，方法准确，灵敏度高，满足检测要求。 实验中采用变色龙软件控制及数据处理，可以完美完成衍生操作及后续对结果的处理，方便、简便，易于操作。 ( [1]李爱军，张代辉，马书民等.液相色谱-串联质谱法测 定饲料中三聚氰胺残留分析化学，2008，36(5)：699-701. ) ( [3] S. Squadrone * ， G.L. Ferro， D . M archis e t c. Determination ofmelamine in f eed： Validation of a gas chromatography-massspectrometry method according t o 2004/882/CE re g ulation.food control 2010， (21)：714 - 718 ) ( [4] NY/T1372 - 2007，饲料中三聚氰胺的测定 ) ( [5] GB/T 22288-2008，植物源产品中中三聚氰胺、三聚氰酸 一酰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸的测定 )