猪肾中β-受体激动剂检测方案(固相萃取仪)

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226.2/152.1* 240.2/148.1*240.2/222.3 全自动固相萃取-高效液相色谱-质谱/质谱法检测猪肾中的β-受体激动剂 编号：J-ANIET-2 摘要：参考国标 GB/T 21313-2007，建立了检测猪肾中β受肾激动剂残留量的 ASPE-HPLC/MS/MS (ASPE， Automatic Solid-Phase Extraction) 法。猪肾中添加β受体激动剂，特布他林0.5 ng、沙丁胺醇0.5 ng、莱克多巴胺0.5 ng 和克伦特罗 0.05 ng，样品处理后进行 ASPE 净化。HPLC/MS/MS 检测显示：特布他林、沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺在 0-5.0 ng/kg 范围内，线性关系良好，加标回收率分别为：76%、113.2%、99%、110%。该方法回收率和稳定性好，适用范围广，满足检测要求。关键词：猪肾，β受体激动剂，，ASPE-HPLC/MS/MS 1样品处理 1.1样品提取 称取猪肾样品5.0g 加入8 mL pH=5.2的乙酸铵缓冲溶液，涡旋混合2 min， 加20pLβ-盐酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酯酶， 超声振荡 15 min 后，恒温37℃培养16h， 酶解后，4℃下离心5 min， 收集上清液， 残渣用5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，涡旋振荡5 min， 合并两次提取液，用1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH=4.0， 上清液用 EXTRA-ASPE净化， 净化液45℃氮吹浓缩至近干，供HPLC/MS/MS分析用。 1.2样品ASPE净化 (1)待净化液采用 EXTRA-ASPE 进行净化。 (2)在混合型强阳离子交换 SPE (Solid-Phase Extraction)小柱上装上3mL柱密封塞。 (3)将塞好密封塞的固相萃取小柱放入 EXTRA 全自动固相萃取仪的3 mL SPE 架上。 (4) 将溶剂瓶 S1 中装入600mL 0.1mol/L HCl； 溶剂瓶S2 中装入600 mL 2%甲醇水溶液；溶剂瓶 S3 中装入600mL5%氨化甲醇溶液；溶剂瓶V1 中装入800 mL甲醇溶液。 (5)在控制 EXTRA-ASPE 系统的 PC软件方法设置界面上，设置猪肾中β受体激动剂的固相萃取方法(详细步骤参见表1) 表1ASPE 净化详细方法列表 动作 位置 溶剂 体积 抽溶剂速度 打溶剂速度 清洗 外针 水 9.8 mL 默认 120 mL/min 活化 甲醇 3.0 mL 15 mL/min 1.0 mL/min 空气 0 mL 活化 水 5.0 mL 15 mL/min 1.5 mL/min 空气 0.5mL 默认 5.0 mL/min 上样 样品 5.0mL 10 mL/min 1.5 mL/min 空气 0mL 清洗 外针 水 9.8mL 默认 120mL/min 淋洗 水 3.0mL 15 mL/min 1.5 mL/min 空气 0.5 mL 默认 5.0 mL/min 淋洗 甲醇 3.0 mL 15 mL/min 1.5 mL/min 空气 9.8 mL 默认 20mL/min 洗脱 5%氨化甲醇 6mL 10 mL/min 1.0 mL/min 空气 2.0 mL 默认 5 mL/min (6)将待净化样品放入样品架内。 (7)设置运行界面，开始样品净化操作。 (8)固相萃取完成后，净化液于45℃下氮吹至近干，用乙腈/水(V/V， 1/9)定容至1.0mL， 过0.22 um 有机滤膜， 供HPLC/MS/MS分析。 2 色谱检测条件 2.1高效液相色谱条件 色谱柱： C18，4.6×150 mm， 3 um 流动相：A：含0.1%甲酸、5 mmol/L 乙酸铵水溶液B：含0.1%甲酸的乙腈 进样量：30pL 流速：600 mL/min 柱温：常温 表2梯度洗脱程序表 时间(min) 流动相A 流动相B 0 95 5 2 60 40 4 40 60 6.5 1 99 6.6 1 99 6.7 95 5 11 95 5 2.2质谱条件 离子源：电喷雾ESI 扫描方式：正离子模式 检测方式：多反应监测 电喷雾电压：4000V 雾化气压力：65 psi 气帘气压力：30 psi 辅助气压力：60 psi 离子源温度：350℃ 检测离子对、碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞室出口电压(CXP)如表2所示 表3碰撞电压、去簇电压、碰撞室入口电压、碰撞室出口电压参数表 名称 定性离子对 (m/z) (CE) (V) (DP)(V) (EP)(V) (CXP)(V) 克伦特罗 277.3/132.2 18 45 8 19 277.3/203.2* 20 50 8 19 莱克多巴胺 302.3/164.2* 12 50 9 15 302.3/107.1 22 50 9 15 沙丁胺醇 240.2/148.1* 25 55 3 12 240.2/222.3 17 75 3 12 特步它林 226.2/152.1* 23 48 8 8 226.2/107.1 24 45 8 4 D6-克伦特罗 283.1/265.1 25 50 14 10 D6-莱克多巴胺 308.1/168.0 23 53 9 17 D3-沙丁胺醇 243.2/151.1 22 55 9 12 D3-特布它林 229.4/110.1 43 45 10 10 注：“*”为定量离子 226.2/107.1 图1-1-1特布他林标准 HPLC/MS/MS 色谱图 226.2/152.1* 226.2/107.1 图1-1-2猪肉中特布他林加标 HPLC/MS/MS色谱图 243.2/151.2 图2-1-1沙丁胺醇标准HPLC/MS/MS色谱图 240.2/148.1* 240.2/222.3 图2-1-2猪肉中沙丁胺醇加标 HPLC/MS/MS 色谱图 302.2/164.2* 302.2/107.1 00 6 8 10 图3-1-1莱克多巴胺标准 HPLC/MS/MS 色谱图 图3-1-2猪肉中莱克多巴胺加标 HPLC/MS/MS色谱图 277.0/203.2* 277.0/132.2 图4-1-1猪肾中克伦特罗标准 HPLC/MS/MS色谱图 277.0/203.2* 277.0/132.2 6 10 图4-1-2猪肉中克伦特罗加标 HPLC/MS/MS色谱 表2样品加标回收实验 序号 化合物名称 标准加入量(ng) 实测值 (ng/mL) 回收率(%) 1 特布他林 0.5 0.38 76 2 沙丁胺醇 0.566 113.2 3 莱克多巴胺 0.55 110 4 克伦特罗 0.05 0.0495 99 3.结论 建立了 ASPE-HPLC/MS/MS 法测定猪肾中β受体激动剂残留量的分析方法。猪肾中添加β受体激动剂，特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺各0.5 ng， 克伦特罗 0.05 ng 时， HPLC/MS/MS 实际测定含量分别为：特布他林0.38 ng、沙丁胺醇 0.566 ng、莱克多巴胺 0.55 ng， 克伦特罗 0.0495 ng。 实验显示：特布他林、沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺的加标回收率分别为：76%、113.2%、99%、110%。该方法准确可靠，操作方便，重现性好。适合猪肾脏中β受体激动剂残留量的快速、准确检测。