牛奶中黄曲霉毒素检测方案(液相色谱仪)

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版权所有 ◎2014， PerkinElmer， Inc. 保留所有权利。PerkinElmer@是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其他所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 序言 黄曲霉毒素是已知的致癌性最 强的真菌毒素，包括黄曲霉毒 素B1，B2，G1 和G2。这些毒素是 通过产毒素的菌株，像黄曲霉菌，寄生曲菌等，在植物种子种植收割后，暴露在温度高，湿度大的环境下生成的。黄曲霉毒素B1认为是最具遗传毒性的真菌毒素，当奶牛摄取含有该毒素的食物时，会转化成黄曲霉毒素M1，虽然没有黄曲霉毒素B1的毒性大，但是在某种动物身上可以导致肝癌。牛奶最易受黄曲霉毒素污染，在放牧/喂养奶牛时，最容易吸收和浓缩该毒素。这样说吧，M1认为是最初级的黄曲霉毒素，预计可以在牛奶中发现，欧盟已经建立了M1的应急控制限量，牛奶中限量为 0.05ppb。这是当前最严格的全球控制限量，明显低于 FDA 0.5ppb 限量。 用带有荧光检测器的 HPLC， 结合柱后衍生，分析黄曲霉毒素是通用的分析方法，B1，G1 和其他毒素一样，自身不可以放出荧光，但是通过特色的 Kabra 池，通过电化学原理溴化这两种毒素， 可以极大地增强他们在低浓度时的响应灵敏度，使用这种方法，通过 HPLC 可以分析检测全脂或者1%脂肪的牛奶，浓度在 ppb/ppt 水平的全部 B1，B2，G1，G2 和M1黄曲霉毒素。这个过程比较简单，使用免疫亲和固相萃取方法学，去制备处理和净化样品。 实验 硬件/软件 PerkinElmerAltus UUPLC系统，包括A-10样品和溶剂传递模块，柱加热器和A-10 FL荧光检测器，对于柱后衍生，需要使用 Kabra 流通池。 PerkinElmer Brownlee C18色谱柱(3um，4.6x100mm)。全部的仪器控制和数据分析，使用 Waters 的 Empower 3CDS软件。 方法参数 HPLC 的方法参数显示在表1 Table 1. HPLC Method Parameters. HPLC Conditions PerkinElmer Brownlee C18， 3 um， Column 4.6 x 100-mm (Part# N9303507) Immunoaffinity Column AflaPureimmunoaffinity column， 3 mL (BioScientific) Mobile Phase 17：23：60 acetonitrile/methanol/water Analysis Time 10 min Flow Rate 1.1 mL/min. (~5000 psi maximum pressure) Oven Temp. 30°C FL Detection Excitation (Ex)： 362 nm， Emission (Em)：435 nm Injection Volume 100 pL Sampling (Data) Rate 5 pts./sec Diluent Water 试剂，标液和样品 所有的试剂和稀释液要求HPLC级别，上样前通过0.45um过滤。 使用乙腈配制20ug/ml (20ppm)的黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2标准贮备液，这些标准品从 Sigma-Aldrich 公司采购。一个10ug的M1 黄曲霉毒素标液从Sigma-Aldrich公司采购，然后使用水配制成 10ug/ml(10ppm)标准贮备液。分别吸取 50ul 的B1/B2/G1/G2的标准贮备液和100ul的M1标准贮备液到 100ml的容量瓶，然后用水稀释定容到刻度，制备成10ppb 的黄曲霉毒素的工作液。为了做标准曲线，连续用水稀释黄曲霉毒素标液，配制成浓度为3.82，0.764，0.382，0.0765和0.0382ppb。 全脂或1%脂肪的牛奶，采购于当地的杂货食品店，每个牛奶做一次平行样， 在 50ml的离心管中，先加入40ml的牛奶，然后再加入800ul 浓度为 3.82ppb 的黄曲霉毒素标液，配制成最终上样浓度为 0.0765ppb的加标样品，接着加标样品旋涡1min， 为了制备牛奶提取液，每个加标牛奶样品，需要再稀释10倍，先取2.5ml的牛奶样品到50ml管中，接着再添加22.5ml的水和0.6g氯化钠，均匀混合该样品管，最后旋涡1ml 和离心 10ml，转速5500 rpm。然后取20.0ml脱上上清液，装样到规格为3ml的黄曲霉毒素免疫亲和 SPE 柱上，以1滴/秒的速度装样，(注意：不能让 SPE小柱填料变干)，接着用10ml的90：10的水/甲醇混合洗脱液，以1-2滴/秒的速度，洗脱 SPE小柱，直到空气通过 SPE 小柱. 对于1%脂肪牛奶的加标样，洗脱黄曲霉毒素还需要注入800ul的纯甲醇，以1滴/秒的速度，洗脱液收集在15ml的圆底离心管中，然后等空气通过 SPE小柱后，再使用2ml70： 30比例的水/甲醇混合洗脱液洗脱，最后取1ml的溶液转移到自动进样器小瓶中，然后进样(进样100ul)。 对于全脂奶的加标样，洗脱黄曲霉毒素还需要注入2.5ml的纯甲醇，以1滴/秒的速度，洗脱液收集在15ml的圆底离心管中，然后洗脱液弄干到大约0.25ml，然后再使用70：30比例的水/甲醇溶液，恢复定容到2ml，然后取1ml的溶液转移到自动进样器小瓶中，然后进样(进样100ul) 结果与讨论 图1显示了水平3 (0.382ppb) 的黄曲霉毒素校准液的色谱图(图A)和水平1 (0.0382ppb)的黄曲霉毒素校准液的色谱图(B)，所有5种黄曲霉毒素在小于6分钟的分析时间内等度洗脱出来。 如图2显示，通过10次重复进样水平3校准标液，确定色谱的重现性，结果显示了一个优异的再现性，所有黄曲霉毒素保留时间的RSD%小于/等于0.05%。 为了测定系统残留，重复3次进样水平5高浓度(3.82ppb)标样后，再进一针空的流动性。结果显示在图3中，色谱图显示没有检测到残留。 Figure 2. Overlay of 10 replicates of the Level-3 (0.382-ppb) calibrant. Figure 3. Chromatogram of a mobile phase blank injected after three replicate injections ofLevel-5 calibrant. 图4显示了，以黄曲霉毒素M1和B1为例子的标准曲线图，曲线的线性(R)大于0.999. Figure 4. Linear calibration plots of aflatoxins M1 (A) and B1 (B)； concentration range： 0.0382-3.32 ppb. 根据信噪比大于10：1，确定所有黄曲霉毒素的定量限(LOQ)，结果显示，可以很容易的测定欧盟规定的，在牛奶中最大可以容忍的黄曲霉毒素M1浓度低于0.05ppb 定量限。数据列于表2中。 Table 2. Retention times (RT) and LOQs for aflatoxins M1， G2， G1， B2 and B1； asextrapolated based upon the Level-1 (0.0382 ppb) standard. Aflatoxin RT (min) LOQ (ppb) M1 2.98 0.018 G2 3.31 0.005 G1 3.97 0.005 B2 4.42 0.002 B1 5.41 0.005 图5和图6分别显示了，加标0.0765ppb 的1%脂肪的牛奶和全脂牛奶的色谱图， 应该注意，再计算黄曲霉毒素M1的定量限时，应根据加标样品计算，1%脂肪的牛奶的定量限是 0.018ppb，全脂牛奶的定量限是0.025ppb， 仍小于等于欧盟控制限量的一半值。 Figure S. Chromatogram of the 0.076S-ppb spiked 1% milk. Figure 6. Chromatogram of the 0.0765-ppb spiked whole milk. 加标样品回收率显示在表3中，所有的值都是两次测定的平均值。0.0765ppb加标在1%的牛奶样品中，回收率是很好的。加标全脂牛奶的加标样品回收率，基于这样复杂的样品基质提取液，回收率也较好，而且有较低的分析浓度。 Table 3. Recovery results for duplicate sets of 0.0765-ppb spiked milk samples(n=3for each sample). Sample B1(%) B2 (%) G1 (%) G2 (%) M1(%) 1%Milk #1 91.4 94.1 95.3 70.2 85.6 1% Milk #2 91.0 97.7 94.6 70.2 92.8 Avg. for 1% Milk 91.2 95.9 95.0 70.2 89.2 Whole Milk #1 87.7 76.5 70.1 68 92.4 Whole Milk #2 81.3 75.2 68.0 65.5 86.8 Avg. for Whole Milk 81.5 75.9 69.1 66.8 89.6 该工作证实了，使用 PerkinElmerAltus HPLC 系统，带有 A-10 FL 检测器和 Kobra 流通池和柱后衍生，再结合SPE 样品净化小柱，可以有效的分离和定量黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2和M1。结果显示，在测定的浓度范围内，每种黄曲霉毒素都有很好的线性，定量限低于 0.02ppb，而且有好的回收率，在低于0.02ppb 的定量下限，也可以允许日常分析全部5种黄曲霉毒素，其中牛奶中黄曲霉毒素 M1 远低于欧盟规定的 0.05ppb 的可接受限。 ( 1. FDA Compliance Policy Guide， u n der Inspections， Compliance，Enforcement， and Criminal Investigations； CPG Section 527.400 W hole Milk， Lowfat Milk， Skim Milk-Aflatoxin M1. ) ( 2. Commission R egulation (EU) No 165/2010. Amending Regulation (EC) No 1881/2006 Setting Maximum Levels for Certain Contaminants in F o odstuffs as Regards Aflatoxins.Official Journal of th e European Union， F eb 26， 2010， p p L 50/8-L50/12. ) 地址：上海张江高科技技区张衡路1670号 邮编：201203 电话：021-60645888 传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：//www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs