白酒中甜味剂检测方案(液相色谱仪)

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「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 2016年8月 UPLC-MS/MS法快速测定中国白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂含量 柯润辉 摘要 建立了超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂(安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、阿力甜和甜菊糖苷)含量的分析方法。样品经蒸馏水稀释一定倍数后，过0.22um微孔滤膜，直接进入UPLC-MS/MS中分析检测。WatersHSS T3色谱柱为分析柱，甲醇-0.1%乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾电离源正负离子切换多反应监测模式检测。结果表明：氨基甲酸乙酯和8种甜味剂在3-500ug/L的范围内线性关系良好(相关系数R>0.998)，方法检出限在1 pg/L-3pg/L之间，基质加标回收率在89%-106%之间，相对标准偏差≤9%，完全满足日常检测的要求。该方法前处理简单，测定快速、准确、灵敏度高，非常适合白酒中氨基甲酸乙酯和多种甜味剂的快速筛查和定量分析。 关键词 超高效液相色谱-串联质谱仪；白酒；氨基甲酸乙酯；甜味剂 近年来，随着消费和认识水平的提高，食品的营养和健康逐步成为消费者关心的重点。因此，食品中的有害物质和添加剂的使用情况越来越受到人们的关注。氨基甲酸乙酯(EC)是发酵食品在发酵和贮存过程中天然产生的化学污染物。2007年，世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)正式将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物(对人类为很可能致癌物)，认为经食物和饮料酒摄入的EC总量，可能对健康造成潜在危险I21。甜味剂是一类十分重要的食品添加剂，用以改善食品口感和风味，非糖类甜味剂由于其低热量、高甜度、适合糖尿病人食用等特点而成为蔗糖替代品在食品工业中广泛使用。食品添加剂在规定的剂量范围内使用对人无害，若超量使用，则可能引起各种形式的毒性表现。因此，必须对其使用量进行严格管理。 中国白酒历史悠久，是中华民族宝贵的文化遗产和特有的传统产品。虽然我国尚未制定酒精饮料中氨基甲酸乙酯的限量标准，但白酒中氨基甲酸乙酯问题已经引起行业的关注，成为生产企业日常监控的重点指标。品质优良的白酒由于其复杂特殊的酿造工艺，在发酵过程中就能产生一些醇甜物质(高级醇、多元醇、氨基酸等)，适度的甜味不仅可以遮盖酒类发酵过程中的苦涩等杂味，而且能使酒醇厚，绵软。为了保护我国传统产品，我国食品安全国家标准中明确规定白酒不允许添加任何甜味剂，但个别生产企业为了降低成本，掩盖其产品的口感缺陷，仍违规添加甜味剂。近些年来，国家有关部门在对全国白酒的抽检过程中发现，滥用甜味剂现象时有发生，因此白酒中甜味剂也成为国家食品安全监督抽检重点项目。随着我国食品安全监管水平的提升，为提高工作效率，方便监管部门 和生产企业对白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂的日常监测，有必要开发灵敏度高、适用性广的高通量检测方法，这不仅是技术发展的需求，也是实际应用的需求。 目前，饮料酒中氨基甲酸乙酯的检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱-荧光检测器法5]、气相色谱-质谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱-串联质谱法I8]等；白酒中甜味剂的检测方法主要有离子色谱法9]、气相色谱法I10]、液相色谱法、气相色谱-质谱法12]、液相色谱-串联质谱法[13]等。虽然关关检测方法的报道很多，但经文献检索，目前尚未见到同时测定饮料酒中氨基甲酸乙酯和多种甜味剂的方法报道。由于液相色谱-串联质谱仪的高选择性与高灵敏度，其在食品安全检测中的应用越来越广。本文建立了超高效液相色谱-串联质谱仪同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、阿力甜、甜菊糖苷8种常见甜味剂的方法，简便、快速、灵敏度高，为大批量的白酒监督抽查和企业日常监控提供及时准确可靠的技术手段，并大大提高工作效率和降低检测成本。 材料与方法 仪器与试剂 超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC， 美国Waters公司)-串联四极杆质谱仪(ACQUITYTQD， 美国Waters公司)； Milli-QReference超纯水发生器(美国Millipore公司)；0.22um有机滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)。 甲醇、乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)；甲酸、乙酸(HPLC级，迪马科技有限公司)；乙酸铵(分析纯，迪马科技有限公司)；实验用水为Milli-Q超纯水；氨基甲酸乙酯(EC)(纯度99.9%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；8种甜味剂标样：糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、甜蜜素、甜菊糖苷(苷度>98%，美国Sigma公司和加拿大TRC公司)，阿力甜(纯度>98%，加拿大TRC公司)。 标准溶液的配制 分别准确确取10mg(精确至0.1mg)氨基甲酸乙酯、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、甜蜜素、甜菊糖苷和阿力甜标准品于10mL棕色容量瓶中，用超纯水溶解并定容至10mL(其中氨基甲酸乙酯用甲醇溶解定容)，配制成1mg/mL的标准储备液。阿斯巴甜在中性水溶液中易分解，配制时需加入少量乙酸(使溶液pH=4.3左右)。上述标准溶液置于4℃冰箱中保存，根据使用需要用流动相溶液逐级稀释成适当浓度的混合标准工作液。 样品前处理方法 准确吸取白酒样品5.0mL于10mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，混匀，经0.22um有机滤膜过滤，滤液供LC-MS/MS测定。 色谱条件 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3(100 mmx2.1mm，1.8 pm)； 柱温为40℃；进样量：10pL；流动相：A相为甲醇，B相为0.1%乙酸水溶液；流速：0.35mL/min；梯度洗脱程序： 0min，10%A； 0-4min， 10%A-90%A； 4.0-4.5min， 90% A； 4.51min-6.5min，10%A。 质谱条件 质谱仪选用电喷雾离子源，根据被测物在正、负离子模式下的灵敏度不同而分类检测，采用多多应监测模式(MRM)定量。质谱采用正、负离子模式时，毛细管电压分别为1.0kV和2.9kV，脱溶剂气和锥孔气流量分别设为700L/h和50L/h，离子源温度和脱溶剂气温度分别为110℃和400℃。 结果与讨论 色谱和质谱条件的优化 色谱条件的选择 实验考察了BEHC柱和 HSS T3柱对氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的分离效果，发现两款柱子均能较好的分离9种被测物，但在相同的分离条件下，T3柱的分离效果更好。由于某些被测物极性较强，流动相的洗脱能力不宜过强，同时乙睛的毒性较甲醇大；又由于流动相要进入质谱仪，添加一定量的缓冲盐可以增加响应值；所以考虑甲醇-水、甲醇-乙酸铵溶液、甲醇-乙酸水溶液三种流动相体系。以被测物在色谱柱上的分离度、峰形、灵敏度等为考察指标对三种流动相体系进行了比较。结果表明，从各物质分离度、峰形、响应值以及保留时间的稳定性等指标进行综合衡量，0.1%乙酸-甲醇做为流动相时优于其余两种流动相，故实验选用0.1%乙酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱。 质谱条件的选择 质谱采用注射泵直接连续进样方式进行全扫描检测，得到被测物一级质谱图和准分子离子峰，再用惰性气体Ar轰击该母离子，获得其二级质谱图及相应子离子。结果发现，氨基甲酸乙酯在正离子模式下响应值高于负离子模式，而8种甜味剂在负离子模式中响应值较高，因此，本方法选择正负离子切换监测的方式，正离子模式监测氨基甲酸乙酯，负离子模式监测甜味剂。除氨基甲酸乙酯、甜蜜素和甜菊糖苷的母离子裂解时只得到一个明显的碎片子离子外(表1)，其余6种被测物均获得了丰富的碎片离子。利用多反应监测(MRM)模式对选定的定性和定量离子对进行质谱毛细管电压、碰撞能量、锥孔电压等质谱参数进行优化，使各监测离子丰度和信号达到最强，所得最佳质谱条件参数见表1。在优化的色谱和质谱条件下9种被测物的总离子流(TIC)色谱图见图1。 化合物 母离子 子子离子 碰撞能量 锥孔电压 离子检 (m/z) (m/z) (eV) (V) 测模式 氨基甲酸乙酯 89.9 61.9* 5 17 ESI+ 安赛蜜 162.0 82.0*，78.0 15，26 26 ESI- 糖精钠 182.0 42.0， 106.0* 27，17 40 ESI- 甜蜜素 178.2 79.8* 27 50 ESI- 三氯蔗糖 394.9，396.9 359*，361 11，11 36 ESI- 阿斯巴甜 293.1 146.1， 200.1* 16，15 29 ESI- 阿力甜 330 295，312* 18，13 35 ESI- 纽甜 377.3 200.1*， 230.1 15，17 36 ESI- 甜菊糖苷 803.4 641.1* 25 18 ESI- 表1氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的质谱分析参数 Table1 MS/MS parameters for EC and 8 sweeteners 注：*定量离子 图1氨基甲酸乙酯(100pg/L)和8种甜味剂(200pg/L)混合标准溶液的总离子流色谱图 Fig. 1 TIC chromatograms of EC (100 pg/L) and 8 sweeteners standardsolution(200 pg/L) 注：1.氨基甲酸乙酯(1.65min)；2.安赛蜜(1.57 min)； 3. 糖精钠(1.97min)； 4.甜蜜素(2.57 min)； 5.三氯蔗糖(2.79 min)； 6.阿斯巴甜(2.87min)； 6. 阿力甜(3.37 min)； 8.纽甜(4.26min)； 9.甜菊糖苷(4.59 min) 样品前处理条件的选择 白酒基质相对较简单，而液相色谱-串联质谱技术在抗基质干扰、灵敏度方面有较强的优势，因此可在LC-MS/MS上直接进样分析。但考虑到白酒含有高比例的乙醇，若直接进样分析，乙醇会影响极性较大的被测物(氨基甲酸乙酯和安赛蜜)在反相C柱上的保留时间和峰形，导致保留时间偏移，影响检测结果的准确性和重现性。为了消除乙醇对检测的影响，可采用加水稀释、氮吹或旋转蒸发的方法，考虑到氮吹和旋蒸操作相对复杂和耗时，本研究采用加水稀释的方式。稀释的方法可以降低乙醇对色谱峰形影响，减弱基质效应，但是会降低方法的检出限。经过不同稀释倍数样品测试对比，最终确定稀释倍数为2倍。 方法的线性范围和检出限 因白酒的基质效应不明显I14，本研究采用直接配制的标准溶液工作曲线来考察方法的线性和检出限。将含9种被测物的混合标准储备液用甲醇-水(1：9，V/V)溶液稀释，分别配制成含量为3、10、20、100、500 ug/L的混合标准工作液，按2.1所确定的色谱-质谱条件进行测定，绘制标准工作曲线。以目标组分的峰面积y对相应的质量浓度x绘制标准曲线，相关系数(r)都在0.996以上。用信噪比(S/N)为3确定方法的检出限(LOD)，相关参数见表2。 化合物 线性方程 相关 线性范围 LOD 系数(r) (ug/L) (ug/L) 氨基甲酸 乙酯 v=107.09x+213.35 0.9994 3-500 1 安赛蜜 v=68.374x+101.45 0.9999 3-500 1 糖精钠 v=12.475x+56.036 0.9998 3-500 3 甜蜜素 y=201.69x-1064.7 0.9989 3-500 1 三氯蔗糖 v=7.4576x+72.867 0.9994 3-500 2 阿斯巴甜 v=16.162x+86.497 0.9998 3-500 3 阿力甜 v=90.858x+289.98 0.9996 3-500 1 纽甜 v=50.586x+271.22 0.9997 3-500 2 甜菊糖苷 v=94.672x+340.97 0.9998 3-500 1 表29种被测物的线性范围、线性方程、相关系数和检出限 Table 2 Linear range， calibration curves， correlation coefficients (r)， and limitof detection of 9 analytes 精密度和回收率 准确吸取一定量某白酒样品，用微量移液器准确加入一定量的9种待测物混合标准溶液，配成100 pg/L浓度水平进行回收实验，按1.2节所述实验步骤进行处理和测定，进行6次重复实验，计算其回收率及相对标准偏差(RSD)。结果表明，白酒中9种待测物的回收率在89%-106%之间， RSD小于9%(表3)，方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。 化合物 本底 加标量 测定值 回收率 RSD ug/L pg/L pg/L % % 氨基甲酸乙酯 25 100 116 93 4.6 安赛蜜 - 100 91 91 5.9 糖精钠 - 100 93 93 3.5 甜蜜素 - 100 101 101 7.1 三氯蔗糖 100 95 95 3.8 阿斯巴甜 - 100 89 89 6.2 阿力甜 - 100 92 92 5.1 纽甜 - 100 93 93 4.9 甜菊糖苷 100 106 106 8.4 表3白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的添加回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and precisions of EC and 8 sweeteners spiked inChinese distilled spirit (n=6) 注：-为未检出。 图2某白酒样品氨基甲酸乙酯和8种甜味剂选择离子谱图 Fig. 2 MRM chromatograms of EC and 8 sweeteners in positive sample 按所建立的方法对从市场上购买的6个品牌白酒样品(涵盖酱香、浓香、清香、董香、芝麻香和老白干香型)和搜集的4个甜味剂阳性白酒样品进行了检测，每个样品重复测定三次。所检白酒中均检出一定量的EC，部分白酒中检出一定量的安赛蜜、纽甜、糖精钠、甜菊糖苷等(表4)。图2为某白酒样品的质谱图。 表4市售白酒样品中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂的检测结果(n=3)Table 4 Results of EC and 8 sweeteners in Chinese distilled spirit (n=3)注：-为未检出。 结论 本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱仪同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和8种甜味剂含量的快速测定和确证方法，前处理简单、分离度好、准确度和灵敏度高。实际样品的检测表明，该方法能够满足白酒中氨基甲酸乙酯和多种痕量甜味剂残留的分析要求，与国标方法相比，大大提高了分析效率和降低了分析成本。本方法的建立为监管部门和生产企业对白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂的日常监测提供了可靠、准确、高效的技术手段，对提升我国食品安全监管水平具有重要意义。 扫一扫，关注沃特世微信 ( @2016 沃特世公司。Waters， UPLC， ACQUITY， ACQUITY UPLC和The Science of What’s Possible 是沃特世公司的注册商标 。 ) ( 参考文献 ) ( [1] Ough C S. J Agric F o od Chem， 1976， 24(2)： 323 ) ( [2] ARC (International Agency for Research on Cancer) 2007.International Agency f or Research. Volume 96： Alcoholic Beverage Consumption an d Ethyl Carbamate (Urethane)6-13 February 20071-5.World Health Organization，Lyon，Fr a nce.URL：http：//monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol96/mono96-7A.pdf ) ( [3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会。GB 2760-2014食品添加剂使用标准[S]。北京；中国标准出版社，2014 ) ( [4]张雪娜，叶长文，邹更，等。基于基质修饰的多次顶空固相微萃取-气相色普法检测酒精饮料中的氨基甲酸乙酯。色谱，2011，29(8)：701-705。 ) ( [5]陈达炜，苗虹，赵云峰等，酒精度对高效液相色谱-荧光法分析白酒中氨基甲酸乙酯 含量的影响。色谱，2013，31(12)：1206-1210。 ) ( [6]吴平谷，陈正冬。固相萃取结合GC-MS法测定酒中氨基甲酸乙酯。卫生 研 究，2004， 33(5)：627-628 。 ) ( [7]周勇，李晓明，梁德沛等。气相色谱-串联质谱法测定酒中氨基甲酸乙酯的含量。 酿酒科技，2013，5：97-99. ) ( [8]王丽娟，柯润辉，王冰等。超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法直接测定黄酒和葡萄酒中氨基甲酸乙酯。色谱，2012，30(9)：903-907。 ) ( [9 ] 卜宇宏，李明，李静。离子色谱测定白酒中甜蜜素、糖精钠和安赛蜜[]。酿酒，2011， 38(5)：71-73。 ) ( [10]岳志坚。毛细管气相色谱法测定白酒中甜蜜素[]。理化检验：化学分册，2008，8：785。 ) ( [11]程春梅，赵燕，师邱毅等。液相色谱法测定白酒中安赛蜜和糖精钠含量[]。酿酒科 技，2 0 12，6：99-101。 ) ( [12]丁立平。气相色谱-质谱联用法测定酒类中的甜蜜素[J]。酿酒科技，2011，12：101-103。 ) ( [13]刘国英，胡艳丽，万春环等 。 超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(UPLC-MS/MS)同时测定白酒中4种微量甜味剂[]。酿酒科技，2015，6：92-94。 ) ( [14]吴宏萍，杨红文，魏云等。液相色谱串联质谱法测定白酒中氨基甲酸乙酯的方法探 索。酿酒，2015，42(4)：45-48。 ) 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-6156 2666 广州：020-2829 6555 成都：028-67653588 香港：852-29641800 ( 免费售后服务热线：800(400)8202676 www.waters.com ) 本文建立了超高效液相色谱-串联质谱仪同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、阿力甜、甜菊糖苷8种常见甜味剂的方法，简便、快速、灵敏度高，为大批量的白酒监督抽查和企业日常监控提供及时准确可靠的技术手段，并大大提高工作效率和降低检测成本。