防晒品中UVA防护指数检测方案(紫外分光光度)

智能文字提取功能测试中

研究表明，阳光暴晒可能对皮肤造成急性和慢性的影响。紫外辐射中的95%是UVA辐射 (320-400nm)，此类辐射可以穿透皮肤的表皮层，产生活性氧化物 (ROS) 而直接造成DNA的损伤，也会导致DNA和DNA-蛋白质交联结构的单链断裂、真皮层损伤以及胶原蛋白的降解。虽然绝大部分的UVB辐射(290-320 nm)能够被表皮层所吸收，但是此类辐射的细胞毒性和诱变能力更强，直接导致DNA的损伤。UVA辐射的光老化作用是非常显著的。由于其穿透能力较强，UVA辐射是导致表皮和真皮损伤的主要原因。 图1.到达地面的太阳光成分示意图。其中含有50%红外光、40%可见光与10%紫外光。紫外光是太阳辐射中能量最强的部分。 防晒指数(SPF)让消费者可以直观比较防晒产品所能提供的保护水平。防晒产品可以大致分为4种防护等级。 表1.根据标明的SPF值，防晒产品可以大致分为4种防护等级：初级、中级、高级、超高级。 SPF标识值 防护等级 6 初级 10 15 中级 20 30 高级 50 50+ 超高级 防晒指数低于6的产品已经不再被看做是防晒产品，因为这些产品的保护效果太弱，无法实现防晒的主要目的。之前的“遮光 (sun-block)"一词也基本不再使用，以免对消费者造成误导。 单纯使用SPF值评价防晒效果是不完善的。SPF值描述的主要是对UVB辐射的保护效果，不能充分表明产品对于UVA辐射的防护能力。UVA辐射对皮肤的损害已经得到证明，因此亟需建立一些可以评价产品对UVA防护水平 (UVA防护指数，UVA-PF)的测试方法。 对于UVA辐射影响的关注日益增长，因此需要建立可以正确评价防晒产品保护水平的标准方法。欧洲、澳大利亚、德国、英国和美国等已经建立了一些体内和体外测试方法(ISO、AS/NZS、DIN、UK、FDA)，用不同方式评价防晒产品对UVA辐射的防护水平。但是，不同国家建立的方法相互之间难以同步，尚不能用统一标准注明产品对UVA辐射的防护效果。目前主要的体外测试规定方法如右侧所列。 COLIPA 2011/FDA最终条例2011 本文所要讨论的测测方法是COLIPA2011与FDA最终条例2011。为了测定防晒产品的UVA防护指数， COLIPA(欧洲化妆品、盥洗用品及香水协会)在2011年发布了对于体外测试方法的指导原则。FDA最终条例2011规定的测试方法参数与COLIPA 2011基本一致，因此通过一次测试即可同时得到符合两种规定的结果。 根据FDA和欧盟的指导原则，防晒产品不仅要提供UVB防护能力，还要能够抵抗UVA辐射。根据PPD方法(持久性色素沉淀法)得到的体内测试结果或者其他等效的防护能力评价方法得到的体外测试结果，UVA防护指数(UVA-PF)不应低于SPF值的1/3。此外，为了满足UVB/UVA广谱防护能力与相关标识的要求，体外测试结果的临界波长应该高于370 nm。 SPF测试——目前的体外测试规定方法 AS/NZS 2604广谱测试法(2012)该方法的新版 本以ISO 24443“防晒产品UVA防护水平体外测定 (Determination of Sunscreen UVA Protection invitro)"为基础。为了获得防护光谱的宽度性质，需要计算UVAPF比例值与临界波长。 ISO-24443 (2012) “防晒产品UVA防护水平体外测定”。与AS/NZS 2604规定的方法一致，该方法也需要测定UVAPF比例值与防护光谱宽度。 ISO-24442 (2011)该方法是澳大利亚、欧洲、东盟等地区使用的UVAPF体外测试方法的折中。 UVA-UVB比例法(2010)该方法需要测试1.3 mg/cm²的样品薄膜在290 nm到400 nm之间的吸收光谱，然后计算290-320nm之间的吸收光谱面积(UVB区域)与320-400nm之间的吸收光谱面积(UVA区域)的比例。待测样品需要进行预辐照处理。UVA防护水平计算方法为：总防晒指数(TPF) UVA/UVB。可以使用不同的基底材料进行测试。 Boots星级评定法(2011)该方法为英国的Boots公司所使用(非强制方法)。该方法需要测试1 mg/cm²的样品薄膜在290 nm到400nm之间的吸收光谱。待测样品需要进行预辐照处理。产品对UVA防护能力的等级范围为3星级到5星级。星级越高，对UVA的相对防护能力越强。 FDA最终条例2011该方法是目前在美国使用的测试方法。该方法需要测试0.75 mg/cm²的样品薄膜在290nm到400nm之间的吸收光谱。从光谱曲线的UVB一端开始计算，吸收光谱面积达到总光谱面积的90%时对应的波长为临界波长。待测样品需要进行预辐照处理。 DIN 67502 (UVA平衡法)该方法的基础如德国标准DIN 67502所规定。该方法使用CIE提供的数值计算SPF值，对体外测试结果进行校正。通过标准的PPD作用光谱得到待测防晒产品的PPD值。 COLIPA (UVAPF) (2011) 该方法需要计算UVAPF与SPF的比例值以及临界波长。该方法也说明了符合区盟规定的一致性要求。 COLIPA名词定义 体外UVA防护指数(UVAPF)：防晒产品所提供的UVA绝对防护能力，根据辐照处理后样品的体外透过率、PPD作用光谱的权重、具有UVA滤光片的阳光模拟器的标准输出光谱等参数计算得到。 紫外辐照前的体外UVA防护指数(UVAPF(0))：没有经过紫外辐照处理的防晒产品体外UVA防护指数。根据没有经过辐照处理的样品的体外透射光谱、PPD作用光谱的权重、具有UVA滤光片的太阳模拟器的标准输出光谱等参数计算得到，根据标明的SPF值进行调整。 体外防晒指数(体外SPF值)：防晒产品对于能够引发皮肤红斑的紫外辐射的绝对防护性能，根据样品的体外透过率、红斑作用光谱的权重、用于SPF测试的紫外阳光模拟器的标准输出光谱等参数计算得到。 临界波长(入c)：待测防晒产品的临界波长入c定义为辐照处理后样品的吸收光谱面积(从290nm到入c)达到总吸收光谱面积(从290 nm到400 nm) 的90%时对应的光谱波长。样品吸收光谱的测试方法如前所述。 根据FDA最终条例2011的规定，防晒产品的SPF值不低于15而且临界波长达到370 nm时，才可以称之为具有“广谱防护”的能力。需要注意的是， FDA的规定方法已经与COLIPA 2009的UVA测试方法同步，但是前者还没有参照COLIPA2011的测试方法进行升级。 根据FDA最终条例2011的规定，没有通过广谱测试的要求(临界波长低于370 nm)、或者具有广谱防护能力但是SPF值仅在2到14之间时，防晒产品只能宣称有助于避免晒伤，在标签上必需具有“皮肤癌/皮肤老化”之类的警示语。 本文以COLIPA 2011规定的测试程序作为实例。COLIPA已经对其测试程序中出现的一些名词做了规定，包括UVAPF、UVAPF(0)、体外SPF、临界波长等，具体规定如下文所述。 基底材料的选择 SPF体外测试的理想基底材料需要对紫外光有相当的透明度，而且可以模拟人类皮肤的孔隙和纹理。在以往，推荐使用的基底材料包括3M TransporeTM胶带、Vitro-SkinTM和聚氯乙烯薄膜(莎纶保鲜膜)。虽然这些基底材料都能够给出可用的结果，但是难以保证制样过程的一致性是这些材料的共同缺点。 根据FDA和欧盟的最新指导原则，铸造的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) 薄板是现在推荐使用的基底材料。这种薄板由HelioScreen Laboratories独家生产 (http：//helioscreen.fr/en/substrats/Helioplate_HD)。推荐使用的粗糙度约为6微米的HELIOPLATE HD 6 (50 mmx50 mm)符合ISO-24443、COLIPA2011与FDA最终条例2011的要求。图2所示为放置在一小支市售防晒霜前的PMMA薄板，可以看到该薄板粗糙表面的漫反射性质。 COLIPA 2011对于光谱仪器的要求 COLIPA2011操作规程明确提出了对防晒产品测试中所用光谱仪器的要求： ·分光光度计的测量波长范围必需覆盖感兴趣的主要波段，也就是290 nm到400 nm，数据点间隔可以达到1 nm。 ·分光光度计的波长准确度必需优于1 nm。 ·分光光度计的光学系统设计必需能够在各个方向上收集穿过粗糙的PMMA基底的透射光线，无论基底上是否覆盖了防晒产品涂层。推荐使用积分球进行测量，而且积分球的窗口面积占球壁总面积的比例越小，测量准确度越高。 ·线性范围最低要求为2.2吸光度单位。测得的最高吸光度不能超过仪器所用线性范围的90%。因此，紫外/可见分光光度计的设计必需能够有效拒绝杂散光(例如，使用两个单色器)。 图2.放置在一小支市售防晒霜前的推荐用于SPF测试的PMMA薄板HELIOPLATE HD 6 (50 mm x 50 mm，6微米)。 对于积分球窗口面积的规定将体积较小的积分球(也就是说直径低于100 mm的积分球)排除在外，因为小积分球的窗口面积比一般都会达到7~10%。与此相反，150 mm积分球的窗口面积比仅为1~2%。如果不使用积分球附件，常规的分光光度计很难准确测量固体样品的透过率，特别是对于PMMA薄板等具有散射性质的样品。积分球附件所提供的宽散射光线收集角(如图3所示)可以抵消样品散射造成的光线损失。在常规样品舱中测量PMMA薄板时，检测器无法检测到散射光线，所测得的吸光度不准确；使用积分球附件可以收集并测量PMMA薄板散射的光线，因此可以得到准确的吸光度。 图3.SPF测试需要使用积分球附件。上图为常规样品舱的透射测试光路图，样品散射可能导致测量结果出现误差。积分球附件所提供的很宽的散射光线收集角(下图)可以抵消散射光线损失，获得准确的透射测试结果。 与COLIPA推荐的仪器条件相一致，配备了150 mm Spectralon积分球附件的PerkinElmer LAMBDA 650分光光度计是防晒产品体外测试系统的理想选择。LAMBDA 650紫外/可见分光光度计是双单色器设计，测量波长范围从900 nm到190 nm，超低的杂散光水平仅为0.0001%T。线性范围可以达到+/-6A， 波长准确度可达+/-0.15 nm。图4所示为安装了150 mm积分球的LAMBDA 650分光光度计仪器照片，以及积分球设计的顶部视图。 仪器要求―—光度线性度的验证 COLIPA明确要求用于防晒产品测试的紫外/可见分光光度计的光度线性度至少要在2.2A范围内得到验证。安装积分球附件之后，紫外/可见分光光度计的线性范围和光度线性度会明显降低，因此需要对整个分光光度计积分球系统的光度线性度进行验证。 图4.与COLIPA推荐的仪器条件相一致，配备了150 mm Spectralon(蓝菲光学)积分球的PerkinElmerLAMBDA 650分光光度计是防晒产品体外测试系统的理想选择。图中所示为安装了150 mm积分球附件的LAMBDA 650分光光度计仪器照片，以及积分球设计的顶部视图。 COLIPA的附录II描述了使用两块叠加在一起的PMMA校正薄板测试分光光度计的光度线性度的方法。这些校正薄板含有紫外吸收物质，其吸收光谱与很多常见的市售防晒产品类似。这些校正薄板(购自Schonberg GmbH， 订购号951)是从一整张经过紫外线稳定化的标准铸造树脂玻璃板中切割出来的，有助于确保各张薄板光学性质的一致性。 光度线性度也可以用其他测试材料进行验证。作为PMMA校正薄板的替代品，重铬酸钾系列溶液(NIST规程)也可以在防晒产品测试范围内检查分光光度计的光度线性度。使用重铬酸钾系列溶液对安装了150 mm积分球附件的LAMBDA 650分光光度计的光度线性度的测试结果(如图5所示)表明，该系统的线性范围远超过2.2A，相关系数达到0.9992。 在UVWinLabv6软件中建立符合COLIPA与FDA最终条例的测试方法 在控制LAMBDA 650分光光度计的软件 (UVWinLabv6)中可以编辑建立符合COLIPA与FDA最终条例的防晒产品测试方法。一些关键内容如下所述：1)每种防晒产品的测试都需要准备三张不同的PMMA薄板：2)根据COLIPA推荐的测试方法，每块制备好的薄板需要重复测量4次，而且每次测量中光束在薄板上的照射位置要不同(通常是将积分球透射窗口上的薄板旋转90度之后进行下一次测量)；3)制备好的PMMA薄板在被太阳模拟器辐照前后都要进行测试。 图5.使用重铬酸钾系列溶液(NIST规程)在防晒产品测试范围内检查分光光度计的光度线性度。本图所示为重铬酸钾系列溶液在安装了150 mm积分球附件的LAMBDA650分光光度计上的测试结果。相关系数达到0.9992，说明该系统的线性范围符合COLIPA的推荐值。 因此，建立测试方法的最好方式是对样品序列进行编辑，首先测量辐照处理前的PMMA薄板，然后将任务文件保存于UVWinLabv6软件的数据库中，在辐照处理完成后再打开之前的任务文件并继续测量辐照后的PMMA薄板。这样可以获得计算SPF值与生成最终报告所需的全部数据。 建立测试方法的步骤包括： 1.打开LAMBDA650分光光度计的默认扫描方法。设置扫描范围为400nm到290 nm， 纵坐标模式为透过率(%T)，数据点间隔为1 nm。光谱带宽设置为2 nm， 积分时间在0.20秒到0.32秒之间。LAMBDA 650分光光度计参数设置界面如图6所示。 2.单击测试方法文件的“样品信息(Sample Info)"部分，编辑样品次序。样品表中增加了两列：一列是“SPF标签 (SPFLabel)"，用于输入产品上标明的SPF值；另一列是“样品标签(Sample Tag)"， 将各张薄板每次重复测量标记为辐照处理前"或者“辐照处理后”。图7所示为一个样品表 的示例。注意：样品信息是保存于方法文件中的，因此样品次序只需要编辑一次。每次防晒西品测试时样品ID会自动增长。 3.COLIPA 2011规定的SPF-UVAPF计算过程可以直接在测试方法文件中进行编辑，也可以将测得的光谱数据以CSV格式输出，然后用Excel进行离线的数据计算。图8和图9说明了如何在测试方法文件的“处理 (Processing)部分编辑相应的公式，将SPF-UVAPF计算过程植入测试方法中。单击测试方法文件的“处理(Processing)"部分，按次序定义相应的公式并进行添加。公式可以用于算术计算(例如将光谱乘以一个因子)，或者从外部导入COLIPA2011SPF-UVAPF权重系数表以进行所需要的光谱转换。图8所示的公式7中，导入了两个COLIPA定义的权重系数表，可以用于进一步的计算。 在本例中， COLIPA定义的体外SPF值计算公式被分为5步进行编辑，既有算术计算，又有使用权重系数表的光谱转换。 6 Samples Graphs Sample ID Description Type SPF Label Sample Tag 1Sample1 plate1 before Replicate 1 30 before1_1 2Sample1 plate1 before Replicate 2 30 before12 3Sample1 plate1 before Replicate 3 30 before1_3 4Sample1 plate1 before Replicate 4 30 before1_4 5Sample2 plate2 before Replicate 1 30 before2_1 6Sample2 plate2 before Replicate 2 30 before2 2 7Sample2 plate2 before Replicate 3 30 before23 BSSample2 plate2 before Replicate 4 30 before2_4 9Sample3 plate3 before Replicate 1 30 before3_1 10Sample3 plate3 before Replicate 2 30 before3_2 11Sample3 plate3 before Replicate 3 30 before33 12Sample3 plate3before Replicate 4 30 before34 13Sample4 plate1 after Replicate 1 30 after1_1 14Sample4 plate1 after Replicate 2 30 after1_2 15Sample4 plate1 after Replicate 3 30 after1_3 16Sample4 plate1 after Replicate 4 30 after1_4 17Sample5 plate2 after Replicate 1 30 after2 1 18Sample5 plate2 after Replicate 2 30 after22 19Sample5 plate2 after Replicate 3 30 after2 3 20Sample5 plate2 after Replicate 4 30 after2_4 21Sample6 plate3 after Replicate 1 30 after31 22Sample6 plate3 after Replicate 2 30 after3_2 23Sample6 plate3 after Replicate 3 130 after3_3 24Sample6 plate3 after Replicate 4 30 after3_4 图7.本图所示为一个SPF样品表示例。样品表中增加了两列：一列是“SPF标签 (SPFLabel)”，用于输入产品上标明的SPF值；另一列是“样品标签 (Sample Tag)”， 将各张薄板每次重复测量标记为“辐照处理前”或者“辐照处理后”。 图8.在UVWinLabv6软件的测试方法文件中“处理(Processing)”部分可以编辑相应的公式，将SPF计算过程植入测试方法中。公式可以用于算术计算，或者从外部导入权重系数表以进行所需要的光谱转换。本例中导入了COLIPA定义的两个权重系数表以用于进一步的计算。 图9.本例所示为计算体外SPF值所需要的公式。通过浏览找到相应的文件，将COLIPA定义的红斑作用光谱、PPD作用光谱、UVA和UV-SSR光谱辐射度导入测试方法文件中。 建立防晒产品测试方法文件的最后一步是定义所需要的输出报告格式。UVWinLabv6软件中含有一个功能强大的报告编辑程序Communique，让用户可以根据自己的需求而定制报告模板。包含样品光谱与计算结果的模块可以在报告页面上进行拖拽，这些模块的尺寸和位置可以进一步调整。图10所示为一个报告模板示例。报告模板定义完成后，可以被保存并链接到测试方法文件。测试方法文件建立完成之后，可以将其保存下来，以便于编辑和执行。 执行防晒产品合规性测试包含四个基本步骤。 步骤1.在紫外辐照前，对涂抹在PMMA薄板上的防晒产品进行体外透射测量。本步骤是获得初始的紫外光谱，对三块制备好的薄板进行重复测试，每块薄板需要测量四个不同的光束照射位置。 1.如前文所示完成样品信息表。待测产品上标明的SPF值需要填写到相应的列，指定进行重复测量的样品是辐照处理前还是处理后。 2.将空白PMMA薄板放在积分球附件的透射窗口位置，测量100%T透射背景光谱。测量完成后移走空白PMMA薄板。 3.挡住透射光束，测量0%T透射背景光谱。 4.将待测产品制成薄膜状，推荐厚度为1.3 mg/cm²。将待测产品在PMMA薄板上点30次左右，然后用该产品预先饱和过的指套将其涂抹均匀。白色的待测产品应该形成比较透明的薄层。 5.将辐照处理前的1号PMMA薄板放在积分球附件的透射窗口位置。在1号薄板上四个不同位点进行重复测量，每次测量前将PMMA薄板旋转90度。用同样的方法测量剩余的辐照处理前的2号与3号PMMA薄板，每块薄板也要在四个不同位点进行重复测量。 6.辐照处理前的样品测量完成。将任务文件保存在UVWinLabv6软件中，在PMMA薄板经过辐照处理后继续进行测量。 计算待测产品的体外SPF值、相关系数C、UVAPF(0)。根据薄膜厚度对样品光谱进行数学调整，以匹配产品标称的SPF值。 步骤2.使用氙弧灯太阳模拟器辐照PMMA测试薄板，根据COLIPA操作规程的要求对光线进行过滤。 步骤3.对紫外辐照过的防晒产品进行体外透射测试。测量第二组紫外光谱，每块薄板同样需要在不同位点进行重复测量。 1.打开UVWinLabv6软件的任务列表，单击以高亮显示之前保存的任务文件，在工具栏中选择“继续(CONTINUE)"。这样即可对辐照后的PMMA薄板进行重复测量，并且将测量数据附加到之前保存的部分。 2.将空白PMMA薄板放在积分球附件的透射窗口位置，测量100%T透射背景光谱。测量完成后移走空白PMMA薄板。 3.挡住透射光束，测量0%T透射背景光谱。 4.将辐照处理后的1号PMMA薄板放在积分球附件的透射窗口位置。在1号薄板上四个不同位点进行重复测量，每次测量前将PMMA薄板旋转90度。用同样的方法测量剩余的辐照处理后后2号与3号PMMA薄板，每块薄板也要在四个不同位点进行重复测量。 5.辐照处理后的样品测量完成。 步骤4.打印报告。 计算待测产品的UVAPF、SPF/UVAPF比值、临界波长。计算三块PMMA薄板四次重复测量结果的平均体外SPF值、相关系数C、UVAPF(0)、UVAPF、SPF/UVAPF比值、临界波长。 一个防晒产品测试结果报告示例 本例中所测防晒产产品市场上购买，标注SPF值为30的UVA/UVB广谱防晒霜。图11所示为配备150mm积分球附件的LAMBDA 650分光光度计所测量的该样品在辐照处理前和处理后的光谱。 图11.本例中所测防晒产品为市售的标注SPF值为30的UVA/UVB广谱运动防晒霜。图中所示为使用LAMBDA650分光光度计所测量的该样品在辐照处理前和处理后的光谱。 表2. COLIPA 2011 UVA防护水平测试报告。COLIPA 2011 UVA防护水平的测试结果通过本文之前叙述的UVWinLabv6测试方法计算得到。根据图11所示的待测防晒霜样品测量光谱，得到每块测试薄板的体外SPF值、调整后SPF值、相关系数C、UVAPF(0)、UVAPF、SPF(标称值) /UVAPF、临界波长及其重复测量平均值。 薄板 编号 体外SPF值 调整后SPF值 相关系数C UVAPF(0) UVAPF SPF(标尔值) JUVAPF 临界波长 (nm) 1 26.20 30 0.8719 15.70 21.40 1.40 373.8 2 24.50 30 0.8180 16.40 29.00 1.00 373.9 3 26.70 30 0.8904 16.60 22.90 1.30 371.2 平均值 25.80 30 0.8601 16.20 22.40 1.20 373.0 表2所示为该防晒霜的测试结果，其中包含COLIPA规定的SPF-UVAPF计算值。该防晒产品的UVAPF值(大于SPF标称值的1/3)与临界波长(大于370 nm) 都符合COLIPA的标签要求。 结论 ( 明确标注防晒效果的市售防晒产品都需要按照公认的程序进行检测。本文选择COLIPA 2011(欧洲)与略有不同的FDA最终条例2011(美国)作为测试程序的指导原则。防晒产品测试使用的紫外/可见分光光度计需要配备符合相关规定要求的积分球附件，而且系统的光度线性度需要符 合COLIPA规定的范围。 ) ( PerkinElmer提供的配备了150 mm积分球附件的LAMBDA 650分光光度计是防晒产品测试的推荐仪器之一。该双单色器仪器的光度线性度远优于相关规定的要求，而且较小 的积分球窗口面积比也符合COLIPA的推荐要求。 ) ( UVWinLabv6软件可以将COLIPA规定的SPF-UVAPF计算过 程设定为测试方法文件的一部分。使用Communique建立的报告模板可以订制测试结果的最终打印报告格式。 ) ( 参考文献 ) ( 1. Federal Register / Vol. 76， No. 11 7 / Friday， June 1 7， 2 011/ Rules and Requlations. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. Food and Drug Administration. 21 CFR Parts 201and 3 10. [Docket No. FDA-1978-N-0018] (Formerly DocketNo. 1978N-0038) RIN 0910-AF43. Labeling and Ef f ectiveness T esting； Sunscreen Drug Products for Over-the-Counter Human Use. Final Rule. ) ( 2. Method f o r In Vitro Determination o f UVA Pr o tection， 2011， COLIPA (European Cosmetic， Toiletry and Perfumery Association). In Vitro Method f o r t h e D e termination of the UVA P r otection Factor and "Critical Wavelength" Va l ues of Sunscreen Products， G uidelines， 2011. )