白酒中氨基甲酸乙酯检测方案(气质联用仪)

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thermoscientific应用指南 仪器 基于 CSR 技术和内标法 GC-MS测定白酒中氨基甲酸乙酯含量 关键词： CSR技术；内标法； GC-MS。 目标：按照 GB 5009.223-2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》，建立了 ISQ-LT GC-MS 结合 CSR大体积进样技术测定白酒中氨基甲酸乙酯的含量，进样量为13pL， 考察了方法检出限、校准曲线及线性范围、响应值日内日间重复性、保留时间日内日间重复性、系统抗污染能力等，同位素内标法定量。 引言 氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)， 又叫乌拉坦(Urethane )，是一种多位点致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病。人类从膳食中摄入的氨基甲酸乙酯，主要来自发酵食物和饮品，其中酒精饮品是已知的氨基甲酸乙酯主要来源。调查显示，如果饮用氨基甲酸乙酯含量超过30×10 g/kg 的酒，人饮用后患癌的机率大大增加。根据加利福尼亚环保机构的一项统计数据得知，假设每个人的患癌症的机率为1×105，推断氨基甲酸乙酯的摄入量大约为0.7ug/d。因此黄酒中氨基甲酸乙酯是危害人类健康的一个不可忽视的因素。国际上已就不同酒精饮品的氨基甲酸乙酯含量进行了广泛研究，一些国家已制定出酒精饮品的氨基甲酸乙酯最高限量，如加拿大是首个就多种酒精饮品制订氨基甲酸乙酯最高限量的国家，由30pg/L(葡萄酒)至400pg/L (水果白兰地)不等。美国、日本、韩国等亦相继制订出部分酒的氨基甲酸乙酯最高限值。本文按照 GB 5009.223-2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》，建立了 ISQ-LT GC-MS 结合 CSR 大体积进样技术测定白酒中氨基甲酸乙酯的含量，考察了方法检出限、校准曲线及线性范围、响应值日内日间重复性、保留时间日内日间重复性、系统抗污染能力等，同位素内标法定量。 Thermo ScientificTM ISQ单四极杆气质联用仪，包括： -TRACE 1310气相色谱，配分流不分流进样口 -ISQ LT 单四极杆质谱 -AS1310 自动进样器 ( Thermo Scienti ficM T raceFi n d er 3.2.5 1 2 .0 数据处理系统统 ) 耗材 ( Thermo S c i en ti f ic M 毛细管色 谱柱 T G -WAXMS( 3 0 m x0. 2 5 m mx0 . 25 u m 、 P / N 26088-14 2 0 ) 。 ) ( T hermo Sc i enti ficTM K IT SSL - LV TR C13 00 ( P/N 1 9 0 5072 5 ) Thermo Sc i entif icM 预 柱( 5mx 0. 32 m m ) ( P/ N2 6080010 ) T he rm o S ci e nt i ficM 玻 璃两 通( u n i v e r sa l press f it co n nectors ， P / N 35003850) ) ( T he r mo Scien tif ic M超情 性不分流衬 管( P/N 45 3A1925 -U I) Thermo Scient if i c M低流失进样口隔 垫(P /N 3 1 3 0 3233 ) Thermo Scie n t ificM 1 0 uL 液 体 进样 针(P/ N 36 5 20060 ) ) Thermo ScientificM 50uL 液体进样针(P/N36503015) ( Thermo S c ientif i c M 气相色 谱 进 样 口 石 墨 垫 0 .32m m ( P / N 290VA192) ) ( Th erm o Sci e nti f ic M质谱端 石 墨 垫 0.25mm (P/ N 290 3349 6) Thermo Scient if ic M 2mL 进样小 瓶( P / NC4 00 0-88W) ) Thermo ScientificM 2mL 进样小瓶样品架(5×10，C4012-25 Thermo Scientific M 10~100uL移液器(JH91538)Thermo ScientificTM 100 ~ 1000uL 移液器 (JH91348) 试剂与标准品 1)甲醇：色谱纯； 2)样品：95%乙醇(分析纯)。 3)标准物质：氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯购置于德国 Dr.E公司。 标准溶液的制备 1)精确称取 0.0161g(精确至0.0001g)氨基甲酸乙酯标准品(纯度为98.5%)，用甲醇溶剂、定容至10mL，此时 ( 溶液 浓度为 15 85 .8 5 ug/ mL ； ) ( 2)精确称 取 0.0 33 4g(精 确 确 0 . 0 0 0 1g) D5-氨基甲酸乙酯标 准 品 (纯度为98.7%) ， 用 甲 醇 溶剂、定容 至10 m L， 此 时溶液浓度为 3 2 9 6.58ug/ m L ； ) ( 3)100pg/ m L 氨 基 甲 酸乙 酯标 准 品溶液 ：取63pL(1 ) 溶液 ， 加 9 37uL甲醇，定 容 至 1m L ， 混匀 。 ) ( 4)100p g / m L D 5 -氨 基 甲 酸乙 酯标准 品溶 液 ：取30 u L ( 2)溶液 ， 加970 p L甲醇， 定容至1m L， 混匀 。 ) 5) 2pg/mLD5-氨基甲酸乙酯标准品溶液：取20pL(4)溶液，加980uL甲醇，定容至1mL， 混匀。 ( 6) 1 0pg/ m L 氨 基甲 酸 乙酯 标准品溶液： 取100 p L ( 3 ) 溶液，加900uL 甲 醇， 定容至 1 mL，混 匀 。 ) ( 7) 0.5 ug / mL D 5- 氨基甲酸乙 酯标准品 溶 液 ： 取 50 p L( 6 ) 溶 液 ， 加 950uL 甲 醇 ，定容至1 mL ， 混匀 。 ) 标准工作曲线溶液的制备 分别准确吸取氨基甲酸乙酯中间液(0.5ug/mL) 20、50、100、200、400pL和氨基甲酸乙酯标准中间液(10.0pg/mL ) 40、100pL于进样小瓶中，各加2.00ug/mL D5-氨基甲酸乙酯标准液100pL，用甲醇定容至1mL， 得到10.0、25.0、50.0、100、200、400、1000ng/mL的标准曲线工作溶液，现配现用，供 GC-MS分析。 样品制备 取 100pL样品(95%乙醇)，加入2.00ug/mL D5-氨基甲酸乙酯标准液100uL，用甲醇定容至1mL 摇匀待待。 GC-MS仪器条件 ( 1 ) 色谱 柱 ： T G - WAX M S 3 0 mx 0. 2 5 mmx0 .25 um 石英 毛 细管柱 ； ) 2)进样口温度：220℃； 3)升温程序：初始温度为50℃，保持1min， 以8℃ /min升至180℃，保持10min； 4)载气：氦气(纯度≥99.999%)； 5)载气流速：1.0mL/min； 6)进样量：13pL； 8)离子源：El源； 9)离子源温度：250℃； 10)传输线温度：280℃； 11)采集模式： SIM 模式 (44，62，74，89，64，76)。 结果与讨论 ，1采用CSR大体积进样技术测定白酒中氨基甲酸乙酯 1.1 CSR 大体积进样原理介绍 溶剂浓缩大体积进样技术( Concurrent Solvent Recondensation，简称 CSR)，即在进样口和分析柱间连接一段空的预柱，且衬管中装填玻璃棉，采用传统的分流不分流进样口，进样口处于恒定的较高温度，自动进样器插入汽化室5mm，保持针头部分温度较低，快速注入样品。样品以带状液体的状态离开注射器，被收集在衬管底部的少量玻璃棉上，开始缓慢汽化。由于衬管是一个密闭体系，蒸汽体积迅速膨胀，取代和压缩载气，使得衬管内压力迅速增大，而载气阻止了溶剂蒸汽从汽化室溢出，从而产生了“压力涌浪”效应，迫使溶剂蒸汽转移到低温的预柱上。溶剂蒸汽在柱头上冷凝形成液膜，进一步加速了蒸汽的转移，此时溶剂汽化和冷凝同时发生，使得进样体积不再受汽化体积的限制，从而实现大体积进样，预柱起承载样品的作用。图1为CSR基本原理图解， 图2为 CSR 进样过程。 图1.CSR基本原理图解 图2.CSR 进样过程 1.2 CSR 大体积进样技术特点 PTV进样虽然进样体积可高达250uL，但是在溶剂蒸发的过程中会造成低沸点化合物的损失；而 OCI 进样虽然不会造成低沸点化合物损失，但由于样品溶液直接注入到色谱柱中，很容易造成色谱柱的污染，导致某些化合物响应偏低、且影响分离。相比， CSR技术更具有优越性，具备以下三个特点。 1)特点一：显著提高检测灵敏度 CSR 最大进样体积为50uL，能显著提高检测灵敏度。例如：CSR 大体积进样气相色谱质谱中的应用，如图3所示，进样量为1、2、3、4、5uL时所得的结果比较，从图中可以得出，随着进样体积的增加，响应值几乎呈线性倍数增加充分表明增加进样量可以显著提高检测灵敏度。 图3.不同进样体积结果 如图4所示，以正己烷为溶剂，不同环数烷烃的大体积进样分析，进样体积35uL。从图中可以看出比正己烷溶剂多两个碳的化合物C8，并未随溶剂蒸发损失，且高沸点的 C40具有较好的响应及分析精密度，进一步证明了 CSR 对低沸点和高沸点化合物均无歧视效应。 图4.低、高沸点化合物无歧视 3)特点三：简化前处理过程，避免低沸点化合物浓缩时有 损失 如图5所示，在环境水体中 PAHs的分析，一般需要浓缩1000倍，进样量为1pL，采用液液萃取和 SPE 小柱富集两种方式均消耗大量溶剂，且费时，在氮吹浓缩过程中容易造 成低沸点 PAHs 的损失。因此可以采用类似液液微萃取的方式，只需1mL有机溶剂，20mL水样，无需氮吹浓缩，萃取后可直接进样分析，进样量为50uL，，可达到相同效果，甚至更好，既可以大大减少样品前处理过程，并避免低沸点化合物的损失。同样，在农残分析过程中，如敌百虫、敌敌畏、甲胺磷等低沸点农药在旋转蒸发和氮吹浓缩过程中也容易损失一部分，从而造成结果不准确，因此可以采用 CSR 技术来解决这一问题。 图5.简化前处理过程 图 7.95%乙醇样品 其中样品中氨基甲酸乙酯平行测试结果为：27.15和23.41 ng/mL， 平均值为25.125 ng/mL。 3检出限及线性相关系数R² 连续5天每天的校准曲线，相关系数R²范围0.9997 ~ 0.9999. 表1.检出限及线性相关系数R² 时间 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 校准曲线斜率 0.00531912 0.00523227 0.00519963 0.00518141 0.00523734 线性相关系数R² 0.9997 0.9999 0.9999 0.9998 0.9999 10 ng/mL的信噪比(S/N) 73 104 90 100 92 出限(DL) pg/mL 0.033 ng/mL 4响应值重复性 (1)日内重复性：将25.0 ng/mL 的氨基甲酸乙酯标准溶液(含同位素内标)-天内连续进样6次，计算 TIC 峰面积RSD%。分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。 表2.响应值重复性 响应值 测试结果 RSD% 日内重复性 目标峰面积 276011.39 284711.20 271079.30 265364.13 265981.86 278117.43 2.74 内标峰面积 2192306.37 2293368.07 2085652.29 2084549.71 2064038.40 2202412.06 4.20 日间重复性 目标峰面积 303080.16 291944.14 297428.75 294605.07 291155.91 302008.80 2.55 308160.71 291896.94 314170.25 298895.97 307073.96 308089.67 307393.96 293736.60 305015.94 295621.57 313143.47 310922.22 内标峰面积 2325128.46 2326706.37 2362960.28 2370044.08 2397726.93 2374633.39 2.89 2407664.27 2340161.47 2505896.68 2407487.95 2490229.81 2523776.97 2416942.59 2341571.10 2482733.01 2400605.17 2538106.24 2473307.01 5保留时间重复性 (1)日内重复性：将25.0 ng/mL的氨基甲酸乙酯标准溶液(含同位素内标)一天内连续进样6次，计算目标峰保留时间 RSD%。分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。 次间隔应≥2小时)，计算目标峰保留时间RSD%，分别报告氨基甲酸乙酯及同位素内标结果。 (2)日间重复性：将上述标准溶液6天内每天进样3次(每 (3)结果表明：目标峰和内标峰保留时间日间重复性为0.00、日内重复性为0.06%，重复性良好。 表3.保留时间重复性 保留时间 测试结果 RSD% 日间重复性 内标峰时间 13.18 13.18 13.18 13.18 13.18 13.18 0.00 目标峰时间 13.09 13.09 13.09 13.09 13.09 13.09 0.00 日内重复性 内标峰时间 13.16 13.17 13.18 13.17 13.18 13.18 0.06 13.16 13.18 13.18 13.17 13.16 13.17 13.16 13.17 13.18 13.17 13.17 13.18 目标峰时间 13.07 13.08 13.09 13.08 13.09 13.09 0.06 13.07 13.09 13.09 13.09 13.07 13.09 13.07 13.08 13.09 13.08 13.08 13.09 使用标准中规定的校准曲线最大浓度标样(1 mg/mL)，连续进样分析20次，报告响应值重复性 RSD%，第一次和最 后一次响应值之差的绝对值与平均响应值的比值。表4所示，系统抗污染能力目标峰为0.02、RSD 为3.44%；内标峰为0.03、RSD 为 3.05%，系统抗污染能力强。 表4.系统抗污染能力 考查参数 测试结果 RSD% 目标峰面积 13472363.69 12941181.11 12731616.67 12641894.85 13532934.44 12280688.11 3.44 13121929.75 12655455.74 12565532.63 12434265.2 12514979.21 12645833.55 12626692.97 12274655.3 12387478.16 12207850.75 11962787.78 13230755.71 13242460.51 13132706.68 / / / / 比值 0.02 内标峰面积 2453757.2 2388769.24 2358900.79 2335484.43 2483387.22 2242000.59 3.05 2418523.93 2322281.37 2314584.08 2290350.44 2325131.49 2328368.09 2334718.99 2260450.06 2297467.25 2265753.29 2255847.4 2434999.55 2437373.57 2398840.72 / / / / 比值 0.03 结论 参考文献 ( 按 照 G B 50 0 9. 22 3-20 14《 食 品安 全国 家标 准 食品 中 氨基 甲 酸 乙酯 的测 定》 ， 建 立了 I S Q - L T GC-MS 结合 CSR 大体积 进 样技术测 定 白酒 中氨 基 甲 酸 乙酯 的 含 量 ，进样量 为 13p L ， 考察了方法 检出限 、 校 准 曲 线 及线性 范 围 、响 应值日内日间 重 复 性、保 留 时间日 内日间重复 性、 系 统 抗 污染 能力 等，同 位 素内标法定 量 。实 验 结 果 表 明 ： 在 10 .0 ~ 1 00 0ng/ mL 浓度 范围内 ，相关 系数 R² 范 围 0 . 99 97 ~ 0.999 9 ， 线 性良好 ； 检 出 限 为 0 .0 3 3 ng /m L ； 响 应 值 日 间 日 内重复性2.55 ~ 4 .20%之 间； 保留 时 间 日间 日内 重 复性0 .00 ~ 0 .0 6% 之 间； 系统抗 污染 能力 目 标峰 为 0 . 02，内 标 峰 为 0 . 03 ，结 果 良 好， 同时 CS R 大体积 进 样技术可以提高 检 出限和灵 敏 度， 该 方法满足分析检测的要求 。 ) ( [1 ] 食品 安全国家标 准 食品中氨 基甲 酸乙酯 的测 定 . G B 5 009. 2 23-2 014. ) 学俱乐部 谱应用技术群 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermofisher.com